HSVsup2;TK与ILsup2;2共表达真核载体的构建及其在A549细胞中的表达的论文.docVIP

　　HSVsup2;TK与ILsup2;2共表达真核载体的构建及其在A549细胞中的表达的论文 【摘要】 目的 构建含有自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsvsup2;tk)和人类细胞因子白细胞介素sup2;2(ilsup2;2)的联合表达质粒载体并观察其在人类肺腺癌细胞系a549细胞中的表达。方法 设计、合成多克隆位点（mcs）插入到质粒psnav中,然后分别从其他不同的质粒剪切片段hsvsup2;tk、内部核糖体进入位点(ires)、ilsup2;2并依次接入到mcs中，最终得到目的质粒psnavsup2;tksup2;iressup2;il2(pmtⅱ)。目的质粒经酶切、dna测序鉴定正确后，转染到a549细胞中。用rtsup2;pcr方法、elisa法检测转染后细胞目的基因的转录和表达；进一步倒置显微镜观察、mtt法检测更昔洛(gcv)对转然后细胞的杀伤作用。结果 经酶切、dna测序、rtsup2;pcr法和elisa法鉴定，双基因真核表达载体pmtⅱ序列正确并能有效表达。进一步倒置显微镜观察和mtt法检测表明hsvsup2;tk/gcv自杀基因系统对a549细胞有明显的杀伤作用。结论 成功构建了pmtⅱ真核表达载体，并观察了其对a549细胞的杀伤效应，为进一步研究hsvsup2;tk/gcv联合ilsup2;2基因治疗肺癌提供实验基础。 【关键词】 肺癌 基因治疗 单纯疱疹病毒胸苷激酶 (hsvsup2;tk) ilsup2;2 0 引言 　　肺癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年上升，在我国城市人口中，它的病死率居各类恶性肿瘤之首。.如何进一步提高治疗效果，降低死亡率一直是人们研究的重要课题。单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦自杀基因系统(hsvsup2;tk/gcv)以其具有的自杀效应在很多肿瘤的治疗研究中都显示了有效的作用，尤以其独特的“旁观者效应”受到广大研究者的青睐，在针对肺癌方面也有一定的治疗作用[1] 。但是肺癌的发生、发展是一个多步骤、多基因参与的过程，而且不同组织类型肺癌细胞其自身生物学特性也存在很大差异，因而国内外有学者提出单一的基因治疗对肺癌细胞的杀伤作用有限[2sup2;3]，宜采用联合治疗来提高有效性。近些年肿瘤的th1/th2免疫反应状态也是国内外研究的热点之一，有文献报道在肺癌患者体内存在thl/th2细胞因子的平衡失调,发生了th1向th2的异常漂移, 存在ilsup2;2等th1细胞因子分泌的不足[4sup2;6]。而且临床上单独应用ilsup2;2治疗肺癌及恶性胸水也显示了一定的治疗作用[7]。基于以上的理论和实验基础，联合hsvsup2;tk和ilsup2;2的双基因治疗有可能提高单基因治疗的效果。在本实验中，我们构建了含有hsvsup2;tk与ilsup2;2双治疗基因的真核表达载体，并初步观察了它在体外对非小细胞肺癌株a549的杀伤效应，为进一步基因治疗研究奠定实验基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　腺相关病毒载体psnav购自北京本元正阳生物有限公司；psc11tk、pcdnailsup2;2为美国梅尔医学院石长信博士惠赠；piressup2;eyfp为加拿大多伦多大学温晓燕博士惠赠；肺腺癌细胞系a549细胞，大肠杆菌dh5α为本室保存；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、dna连接酶试剂盒、去磷酸化酶试剂盒均为takara公司（日本）产品；trizol试剂、lipofectamine2000为invitrogen公司（美国）产品；各种限制性内切酶为fermentas公司（美国）产品、taqdna聚合购自赛百胜公司（上海）；逆转录酶、rna酶抑制剂为promega公司产品（美国）；gcv为湖南五洲通制药有限公司产品；elisa试剂盒购自上海西塘(进口分装)，胎牛血清为杭州四季青公司产品。mcs序列、引物序列以及基因测序由上海生工、上海博亚生物工程有限公司完成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 psnavsup2;tksup2;iressup2;il2载体的构建 psnav本身cmv启动子后的限制性内切酶位点较少，根据插入片段所需内切酶设计、合成mcs，插入载体中。从其他质粒中剪切需要的片段hsvsup2;tk、ires（其前接有一段增强表达的ivs序列）、ilsup2;2并按不同的酶切位点依次插入mcs多克隆位点中，得到最终目的质粒psnavsup2;tksup2;iressup2;il2(pmtⅱ)，酶切鉴定正确后送公司测序。在此构建过程中同时可获得只含有hsvsup2;tk片段的对照质粒psnavsup2;tk(pmt)。 目的质粒构建流程如图1所示： 　　图1 psnavsup2;tksup2;iressup2;il2( pmtⅱ)的构建流程（