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　　RNAi抑制H157细胞Wnt5a表的论文 【摘要】 目的 构建抑制大鼠rna表达与肿瘤转移密切相关。研究发现gc：71588， image在编码区内分别设计了分散于hⅰ和hindⅲ酶切，得到一条长约400bp的目的片段。实验参照promega公司和omega公司的操作指南进行。 图1 sirna设计示意图 1.1.3 主要试剂 细胞总dna提取试剂盒购自promega(usa)，脂质体购自roche(usa)，pcr试剂盒购自大连宝生物公司，细胞培养基dmem购自hyclone公司(usa)，抗a，其他试剂为国产分析纯。 1.2 实验方法 1.2.1 寡核苷酸的退火及连接 将合成的寡核苷酸溶于双蒸水，浓度为1μg/μl。各取1μl加入5μl 10×t4dna连接酶缓冲液中，用双蒸水补至50μl。按照下列条件进行退火： 95℃变性5min；95℃～70℃降温0.1℃/s；70℃保温10min；70℃～30℃降温0.2℃/30s。取出退火后的dna，与载体（pavu6+27，sal ⅰ和xba ⅰ酶切）连接、转化感受态大肠杆菌dh10b。 1.2.2 重组质粒的鉴定 挑选转化子，按照试剂盒操作说明进行dna提取，经hind ⅲ和bamh ⅰ酶切后（sal ⅰ和xba ⅰ之间仅有55bp），0.8%琼脂糖电泳鉴定。对初步鉴定的重组子进行序列测定，确定插入片段与预期相同，大量扩增重组质粒用于转染h157细胞。 1.2.3 细胞培养及基因转染 h157细胞由新桥医院肿瘤科陈正堂教授赠送。培养液组成：dmem、10%小牛血清、100u/ml青霉素、50μg/ml链霉素，于37℃、5%co2条件下培养。细胞培养至对数生长期时，收获细胞转接于6孔培养板中孵育24h 后进行转染。采用阳离子脂质体lipofectamine 2000作为转染试剂，将重组质粒和空载体分别转染h157细胞，500μg/ml g418 筛选4周，最终获得转染后的阳性细胞用于下一步实验。 1.2.4 免疫印迹检测 收集转染后阳性细胞，抽提细胞总蛋白，紫外分光仪测蛋白浓度。调整蛋白上样量进行sdspage，聚丙烯酰胺分离胶浓度为12%（30%丙烯酰胺6.00ml，4×tris·cl/sds 3.75ml, h2o 5.25ml , 10%过硫酸铵0.05ml， temed 0.01ml）。蛋白转移时采用半干转印仪(biorad 公司)，15v，30min。一抗稀释浓度为1∶2 500，二抗稀释浓度为1∶5 000。 2 结果 2.1 rna干扰（rna interference，rnai）载体的构建 将退火后的dna与载体连接，转化e.coli dh10b后可见转化子产生。从中随机挑选5个转化子，提取其dna进行酶???。电泳结果显示：有3个阳性克隆产生。将其送至上海生物工程技术服务有限公司进行dna序列测定，rna编码区同源的小片段（19～23bp）外源双链rna（double stranded rna）导入细胞中，通过一系列细胞内反应引发细胞中相应mrna的降解，从而导致特定基因表达沉默（gene silence）的一种技术。rnai具有高度专一性，能对靶向基因产生特异性强抑制效应，使该基因表达沉默，而对其他基因不产生影响。用rnai技术来抑制靶基因的表达，为治疗寄生虫、病毒感染、癌症、遗传病等疾病开辟了新的研究途径。由于rnai能高效、特异地阻断目的靶基因的表达，已逐渐作为一种代替基因敲除的简单有效工具，在功能基因组学研究、基因治疗等领域越来越受到重视。rna靶序列的1921nt理论上可以在mrna基因的任何位置，因为靶序列只是起导向作用，结合到mrna上以后就可以在各种外切酶的作用下切断mrna，从而降低mrna的稳定性直至最终被完全降解。通常来说，每个目标序列设计3～4对sirna，选择最有效的进行后续研究。本研究针对人rna编码区设计了2对shrna。 高效和稳定的表达是研究基因功能的前提和基础，载体是基因克隆中外源 dna片段的重要运载工具，选择适当的载体至关重要。此外，转染效率的高低也直接影响插入质粒的表达，高效的转染效率对研究目的基因的细胞学功能也至关重要。脂质体是目前实验研究采取的较为常用的非病毒载体之一，具有转染效率高，细胞毒性低，操作简单的特点。 在构建rna干扰pavu6sianabu kurayoshi,naohide oue,hideki yamamoto,et al.expression of ulating cell migration and invasion[j].cancer res,2006,66(21)：1043910448. [2]masckauchan tn,ag