RPHPLC法测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚的含量的论文.docVIP

　　RPHPLC法测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚的含量的论文 【摘要】 　　目的 建立测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚含量的方法。方法 采用反相高效液相色谱法：色谱柱为ultimatetmaqc18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇水(体积比45∶55)为流动相，流速1 ml/min，柱温 30 ℃，检测波长274 nm。结果 丹皮酚的质量浓度在1.024～25.60 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好(r=0.999 0，n=5),平均回收率103.3%，rsd为1.5%。 结论 该方法准确、专属性强、重复性好，可用于测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚的含量。 【关键词】 光合细菌 六味地黄汤 丹皮酚 　　六味地黄汤由宋代名医钱乙首创，是中医著名的滋补肾阴传统代表方剂，由熟地、山茱萸、山药(三补)和泽泻、丹皮、茯苓(三泻)所组成[1]，主治肾阴不足证，从古到今在中医临床广为应用[2]。本实验室在前期研究中，探索性地将光合细菌引入到经典方剂六味???黄汤中，利用光合细菌自身的营养成分及其生物转化功能，达到提高药效的目的。药理实验结果表明，六味地黄汤经光合细菌代谢后，在增强免疫、抗衰老[3]和治疗肾阴虚证模型小鼠等方面的作用均优于传统的六味地黄汤[4]。本文建立测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚含量的rphplc法，为进一步有效控制其质量提供实验依据。 　　1 仪器与试药 　　1.1 仪器 　　po 　　1.2 试药 　　丹皮酚对照品(批号110708200505，中国药品生物制品检定所);缺丹皮六味光合液、六味光合液(实验室自制);psb液(活菌数109个/ml，暨南大学水生生物研究所提供)，甲醇(色谱纯)，无水乙醇、三氯甲烷(分析纯)，自制双重蒸馏水。 　　2 方法与结果 　　2.1 溶液的制备 　　2.1.1 对照品溶液的制备 取丹皮酚对照品1.3 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成质量浓度为25.60 μg/ml的对照品溶液，密封保存，备用。 　　2.1.2 样品溶液的制备 取一定量六味地黄汤生物制剂的样品溶液，调ph值至2，精密量取20 ml，加入20 ml无水乙醇，超声30 min，3 000 r/min离心10 min，滤过，取上清液，即得。 　　2.1.3 阴性对照溶液的制备 取不含有牡丹皮光合细菌代谢的缺味六味地黄汤样品溶液，按“2.1.2”项方法制得阴性对照品溶液。 　　2.2 色谱条件与系统适应性试验 　　色谱柱为ultimatetm aqc18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为甲醇水(体积比45∶55)，流速为1 ml/min，柱温为30 ℃，检测波长274 nm，进样量10 μl。取psb溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液与供试品溶液各10 μl进样，结果表明，丹皮酚色谱峰分离度良好，理论塔板数以丹皮酚计算不低于3 000，分离度大于1.5，阴性对照品无干扰，见图1。 　　2.3 线性关系的考察 　　精密吸取“2.1.1”项对照品溶液1.0、5.0、10.0、15.0、25.0 ml置25 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制得质量浓度为1.024、5.120、10.240、15.360、25.600 μg/ml的对照品溶液，分别进样10 μl，在“2.2”项色谱条件下，测定丹皮酚的峰面积。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为y=97278x-19986,r=0.999 0，表明丹皮酚质量浓度在1.024～25.60 μg/ml范围内与峰面积具有良好线性关系。 　　2.4 精密度试验 　　精密吸取同一对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样10 μl，平行测定5次，测得丹皮酚平均峰面积为635 245，rsd为1.20%。 　　2.5 稳定性试验 　　精密吸取同一供试品溶液10 μl，分别于配制后0、2、 4、 8、12、 24 h进样，按“2.2”项下色谱条件测定，测得样品中丹皮酚平均质量浓度为13.54 μg/ml，rsd为0.63%。表明供试品溶液在24 h内稳定。 　　2 .6 重复性试验 　　称取同一批样品6份，按“2.1.2”项制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件测定，测得样品中丹皮酚平均含量为13.55 μg/ml,rsd为0.95%，表明样品重现性良好。 　　2.7 加样回收率试验 　　取5份已知含量的供试样品25 ml，加入一定量丹皮酚对照品，按“2.2”项色谱条件进行测定，以外标法计算丹皮酚的含量并计算丹皮酚的回收率，结果平均回收率为103.31%，rsd为1.5%,结果见表1。表1 加样回收率试验结果 　　2.8 样品含量测定 　　取3批样品，按“2.1 .2”项方法制备