双菌株协同发酵提高红景天中苷和酪醇含量的研究的论文.docVIP

　　双菌株协同发酵提高红景天中苷和酪醇含量的研究的论文 作者：宋伟舟，孙剑峰，刘玉应， 冯敏， 蒋春，邓小晨 【摘要】 目的从已分离的具有红景天苷转化能力的霉菌中，筛选能协同发酵红景天苷的双菌株组合。方法以重氮盐比色法初步确定菌株组合和双菌株协同主要发酵条件，并用高效液相色谱(hplc)法复筛。结果选出的最优双菌株组合编号为35-42，该组合在最优发酵条件下，发酵后红景天中红景天苷和酪醇含量比原药材分别提高86.29%和118.14%，总有效成分提高94.68%。结论表明双菌株的协同转化作用明显优于单菌株。 【关键词】 双菌株发酵； 红景天苷； 酪醇； 重氮盐比色法； 高效液相色谱 红景天为景天科（crassulaceae）红景天属rhodiola crenulata hook.f.et thoms植物的根及根茎［1］，我国红景天资源大多分布在高寒地区。其有效成分主要是红景天苷及其苷元-酪醇，二者均具有抗缺氧、抗疲劳、抗微波辐射、抗病毒、抗肿瘤等作用。红景天制品是抗高原反应的必备品。随着红景天产品广泛开发和应用，过度采挖使天然资源日趋枯竭［2］，对高原藏区生态环境的破坏严重。.cOm因此，保护性开发野生资源，提高红景天有效利用率显得更加重要。在其他一些植物药材中，苷是从无活性的苷元脱去糖基获得的，可以采用酸解或酶法来水解糖基，简便易行。与之不同，红景天苷和苷元生成是合成代谢，其前体来源不太清楚，从而造成提高其有效成分研究的难度。目前已有的研究主要包括：添加前体物和酶催化剂合成红景天苷、化学合成法［3］、植物细胞组织培养和基因克隆等方法［4,5］，但与应用还有不小距离。文章在前期研究中，已分离到对红景天苷具有转化能力的菌株，通过单一菌株发酵，最高可使红景天原药材中苷含量提高52.83%。本研究进一步采用双菌株协同发酵红景天，使其中苷含量大大高于单一菌株发酵。混合菌株发酵提高红景天苷和酪醇含量研究还未见报道,为利用生物技术提高野生藏药材资源利用率提供新途径。 　　1 材料 红景天购于成都五块石药材市场，经四川大学生命科学学院许介眉教授鉴定系景天科（crassulaceae）红景天属rhodiola crenulata hook.f.et thoms。菌种：本实验室保存，除2号为米曲霉外，其余菌株均为黑曲霉。 培养基：红景天发酵培养基：红景天粉与水以1∶10的比例。固体种子培养基：麸皮∶水=1∶1。液体种子培养基：麸皮∶水=1∶5，煮沸20 min，过滤，取滤液，加mgso4 0.05%， kh2po5 0.1%，(nh4)2so4 0.1%。试剂：酪醇标准品、红景天苷标准品均购于成都思科华有限责任公司，甲醇为一级色谱纯。 　　2 方法 　　2.1 培养方法 　　2.1.1 孢子悬液制备将菌株接种于固体种子培养基，30℃培养48 h，加水洗下孢子，稀释至孢子浓度约108个/ml。 　　2.1.2 菌丝体制备按0.1%接种量将孢子悬液接入液体种子培养基，30℃，200 r/min，时间48 h。 　　2.1.3 红景天发酵培养30℃，200 r/min，时间为2～4 d。 　　2.2 提取方法红景天发酵液用75%的乙醇按照1∶8的比例分别提取3次，合并滤液，得到发酵提取液，用于重氮盐比色法测定和hplc检测。 　　2.3 测定方法 　　2.3.1 重氮盐比色法［6］取发酵提取液5 ml，加入10%的醋酸铅5 ml和饱和硫酸钠2 ml，定容至25 ml，沉淀、离心，取上清液5 ml于20 ml比色管中，其中加2%碳酸钠3 ml及重氮化试剂3 ml，摇匀显色5 min，再加5%氢氧化钠0.5 ml，显色15 min，整个过程在4℃以下进行，稀释10倍，在489 nm波长下测定吸光度。以吸光度高低作为总有效成分（苷和酪醇的总量）的初筛指标。 　　2.3.2 hplc检测［7］色谱条件：岛津lc-6a 高效液相色谱仪；色谱柱为y-c18(10u)200 nm×4.6 mm；流动相为v（甲醇）：v（高水）=25∶75 ；检测波长275 nm；自然ph；柱温为室温；进样量：20 μl；流速1.0 ml·min-1。精密称取红景天苷、酪醇标准品25.00 mg，分别置于25 ml的容量瓶中，无水乙醇溶解定容，制成浓度为1.00 mg·ml-1的标准品，取苷标准品溶液进样2，4，6，8，10，12 μl，酪醇标准品溶液进样1，2，3，4，5，6 μl，测定峰面积，以峰面积（y）与对照液中红景天苷和酪醇的质量（x/μg）作回归计算，得到标准曲线。发酵产物中红景天苷和酪醇的含量测定按以上条件进行。 　　3 结果 　　3.1 双菌株初筛在本研究前期的菌株筛选工作中，已对重氮盐比色法和hplc进行对比测定，证明重氮盐比色法测定红景天总有效成分的结果