富组蛋白5表达质粒构建及抗菌功能研究的论文.docVIP

　　富组蛋白5表达质粒构建及抗菌功能研究的论文 作者：李岩，李明　陈伟强，邝枣园，黄宁 【摘要】 目的 构建富组蛋白5(histidinerich protein5,hrp5)重组表达载体，表达并纯化hrp5蛋白，观察其抗菌作用。方法 用基因克隆的方法构建pet32ahrp5重组表达质粒，经iptg诱导表达后，用亲和层析的方法纯化hrp5融合蛋白，tricinesdspage电泳鉴定其分子量，琼脂糖弥散法检测其抗菌功能。结果 成功构建了pet32ahrp5表达质粒并表达、纯化出hrp5融合蛋白，融合蛋白对致病性大肠杆菌54299和绿脓杆菌pao1有抗菌活性。结论 hrp5是一种抗菌分子，参与了机体的天然免疫防御功能。 【关键词】 富组蛋白5;蛋白表达; 亲合层析;抗菌活性 abstract:objective to express and purify rebinant hrp5 protein and investigate its antimicrobial activity.methods the rebinant prokaryotic expressing plasmid pet32ahrp5 icrobial activity of hrp5 atography and shoonas aeruginosa pao1.conclusion hrp5 protein is a potent antimicrobial molecule and it is involved in the defense of the innate immunity in vivo. 　　key atography; antimicrobial activity 　　 富组蛋白(histidinerich proteins,hrps)为一组分子量为3～5 kd、分子中富含组氨酸的阳离子多肽，主要由灵长类动物腮腺和颌下腺分泌。.1984年研究者首次报道了hrps对变形链球菌、白色念珠菌有抑制生长和杀菌作用[1,2]，随后的研究显示hrps作为一组内源性抗菌肽，参与宿主非特异性免疫防御系统，与多种口腔感染性疾病密切相关。在至少由12种蛋白组成的hrps家族中，hrp1、3、5作为主要富组蛋白，其蛋白质之和占hrps总含量的85%以上。hrp5是hrp3的蛋白裂解产物，由hrp3 n末端的24个氨基酸残基组成，是hrps家族中抗菌效果最强的蛋白[3，4]。本实验利用基因克隆的方法构建了pet32ahrp5重组表达质粒，经iptg诱导后，用亲和层析的方法获得纯化的hrp5融合蛋白，并用琼脂糖弥散法抗菌实验证实重组蛋白的抗菌功能。 　 　1 材 料 　　1.1 主要试剂 　　琼脂糖、溶菌酶、胰蛋白胨、酵母提取物、大豆培养基、过硫酸铵、tris、tricine (sigma公司);丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、temed、蛋白质marker (merck公司);考马斯亮蓝r250 (上海试剂厂进口分装产品);连接试剂盒、限制性内切酶、taq酶(fermentas公司);质粒提取试剂盒、pcr纯化试剂盒(omega 公司);iptg(华美公司);引物、trizol试剂、depc及两步法rtpcr试剂盒(takara公司);histrap kit (amersham公司);致病性大肠杆菌54299、绿脓杆菌pao1、宿主菌de3及原核表达质粒pet32a均为本室保存。 　　1.2 主要仪器 　　纯水仪(millipore公司);超净工作台(苏净集团);pcr 仪(biometra公司);凝胶成相仪(amersham公司);低压色谱仪(amersham公司)。 　2 方 法 　　2.1 hrp5分子片段的制备 　　腮腺组织来源于人因腮腺纤维瘤切除腮腺的正常腮腺组织部分，按说明书用trizol法提取总rna为模板，以oligod(t)18为引物逆转录合成第一链cdna。根据gene bank(登陆号：bc009791，hrp3)设计特异性引物，上游引物p1：5’ccg gga tcc gat tca cat gca aag aga ca3’,含bam hⅰ酶切位点，下游引物p2：5’ctg gag ctc atc gcc tcg atg tga atg3’。含sal ⅰ酶切位点，扩增hrp3 n末端的24个氨基酸编码序列。pcr反应条件为：95 ℃预变性2 min，94 ℃ 变性30 s，53 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸45 s，进行30个循环，最后在72 ℃ 延伸10 min。pcr反应结束后，取5 μl琼脂糖凝胶电泳鉴定，并进