吖啶橙-罗丹明6G荧光共振能量转移及其罗丹明6G荧光猝灭法测定蛋白质.pdfVIP

第 33 卷 分析化学（FENXI HUAXUE） 研究简报 第 4 期 2005 年 4 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 546 ~ 548 吖啶橙-罗丹明 6G 荧光共振能量转移及其 罗丹明 6G 荧光猝灭法测定蛋白质 刘保生＊ 高 静 杨更亮 （河北大学理化分析中心，河北省分析科学技术重点实验室，保定 071002） 摘 要 研究了吖啶橙（AO）与罗丹明 6G（R6G）之间能量转移的最佳条件。在 pH = 7. 20 的 Tirs-HCl 缓冲溶 液，十二烷基苯磺酸钠介质中，AO-R6G 能够发生有效能量转移，使 R6G 荧光增强。蛋白质的加入使 R6G 荧 光猝灭，以此建立了利用 AO-R6G 荧光共振能量转移间接测定蛋白质的新方法。牛血清白蛋白、人血清白蛋 白工作曲线线性范围分别为 1. 0 ~ 31 和 1. 0 ~ 30 mg / L；检出限分别为 0. 32 和 0. 33 mg / L；平行 6 次测定相对 标准偏差为 1. 1% ~ 2. 0% ；回收率为 96. 7% ~ 103. 2 % 。此方法的稳定性好，选择性高，用于人血清试样中总 蛋白含量的测定，与常用的双缩脲法基本一致。 关键词 吖啶橙，罗丹明 6G，荧光共振能量转移，猝灭法，蛋白质 1 引 言 荧光共振能量转移是指电子激发能，在适当的能量给予体和接受体对之间的传递，传递距离最大可 ［ ］ ［ ］ ［ ］ 达 7. 0 ~ 10. 0 nm。该方法已用于无机离子 1 、有机物 2 、生物 3 、分子微区结构的分析以及作为核酸荧 光探针的研究［4］等许多领域。具有比光度法灵敏度高，与常规荧光法和共振光散射相比受瑞利散射光 干扰小，重现性好的特点［5］。本方法作为表征蛋白质的荧光探针的研究尚未见报道。本实验利用吸收 光谱和荧光光谱，研究了在十二烷基苯磺酸钠介质中，以吖啶橙（AO）作为能量给体，罗丹明 6G（R6G） 作为能量受体的能量转移体系，发现当 AO 和 R6G 摩尔比为 1f4 时，其能量转移最好，蛋白质的加入又 使其 R6G 荧光猝灭。以此建立起 AO-R6G 能量转移荧光猝灭法测定蛋白质的新方法。该体系与蛋白 质作用快，方法简便，选择性好，线性范围宽，重现性好。 2 实验部分 2. 1 仪器与试剂 RF-540 荧光分光光度计（日本岛津公司）；F-4500 荧光分光光度计（ 日本日立公司）；UV-265 紫外 可见分光光度计（日本岛津公司）。牛血清白蛋白（BSA）（北京奥博星生物技术责任有限公司）；人血清 白蛋白（HSA）（Sigma 公司）；卵清白蛋白（OVA）（天津现代高科技研究院）；酪蛋白（Casein）。上述蛋白 分别配成 0. 1 g / L 水溶液，于 1 ~ 4C 冰箱中（当日使用）。吖啶橙（AO）水溶液：1. 0 X 10 - 6 mol / L；罗丹 明 6G（R6G）水溶液：4. 8 X 10 - 6 mol / L；十二烷基苯磺酸钠（DBS）水溶液：1. 0 X 10 - 2 mol / L ；三羟甲基氨 基甲烷（Tris）-HCl 缓冲溶液（pH = 7. 20）：0. 05 mol / L。其余试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。 2. 2 实验方法 于 10 mL 比色管中，依次加入 1. 8 m