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　　介孔分子筛SBA15的脂肪酶固定量分析测定的论文 介孔分子筛sba15的脂肪酶固定量分析测定 【摘要】 利用吸附法将假丝酵母脂肪酶(candida rugosa lipase，crl)固定在介孔分子筛sba15上，对比了由单波长紫外分光光度法、双波长紫外分光光度法和二辛可宁酸法(bicinchoninic acid method， bca)法测定的酶蛋白浓度及酶蛋白固定量。结果表明: sba15对紫外吸收有明显干扰，单波长紫外法测定结果远大于双波长紫外法和bca法，双波长紫外法和bca法测定结果较接近。利用bca法测定了不同浓度crl在介孔分子筛上的固定量，考察了固定化酶的泄漏量。在编号分别为lu001和llsd1的介孔分子筛sba15上的载酶量分别为16.6和114.12 mg/g。在缓冲溶液中sba15固定化酶的泄漏率只约为0.5%，可作为良好的酶固定化载体。 【关键词】 介孔分子筛sba15，脂肪酶，酶蛋白固定量，紫外分光光度法，二辛可宁酸法 　　1 引 言 　　介孔材料孔径介于微孔与大孔之间，具有大的表面积和多维孔道结构，介孔硅基分子筛sba15具有高度有序的六边形直孔结构，孔径在5～50 nm范围，对酶分子具有较强吸附能力，是固定化酶的新材料[1]。将酶固定于介孔分子筛上有利于保持酶活稳定性，便于酶的重复利用。.高的酶固定量和低的酶泄露量是固定化效果的重要指标。介孔分子筛载体的酶固定量测定方法有紫外分光光度法[2,3]、bca(bicinchoninic acid method)法[4]、bradford法[5,6]、凯氏定氮法[7]及lo3250b型磁力搅拌恒温器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。 　　介孔分子筛sba15的合成利用表面活性剂pouronic p123(eo20po70eo20, 美国aldrich公司)为模板剂，以浓hcl( 35%～37%)为催化剂，通过对正硅酸乙酯(si(oc2h5)4, teos, 95.0%，日本junsei chemical公司)的分解和硅缩聚反应后而得到。编号lu001和llsd1的介孔分子筛合成方法基本相同，原料量略有不同，二者的bet比表面积762 m2/g，孔容0.87 cm3/g，孔径7.18 nm，壁厚3.55 nm。柱状假丝酵母脂肪酶(candida rogusa lipase, crl)购自日本amano酶技术公司;bca蛋白定量试剂盒购自美国pierce公司。实验用水为二次蒸馏水。 　　2.2 傅立叶变换红外(ftir)测试 　　样品和kbr在115 ℃下抽真空烘干10 h。将300 mg kbr和2.2 mg样品在研钵中混合研磨成细粉后压片，干燥后立刻置于红外光谱仪的石英原位池中测试。仪器分辨率为2 cm-1，扫描波数范围4000～400 cm-1，扫描128次。 　　2.3 crl在sba15上的固定化 　　将crl磷酸盐缓冲溶液(ph 7.0)以3000 r/min离心15 min，收集上清液，得原酶溶液。将适量sba15放入原酶溶液中，在15 ℃水浴和150～200 r/min下搅拌吸附21 h，再以10000 r/min下离心15 min，收集上清液为吸余液。用磷酸盐缓冲溶液清洗分子筛4次以洗脱疏松附着的酶，洗脱液再以10000 r/min离心15 min，取出上清液为清洗液。测定原酶溶液、吸余液和清洗液的酶蛋白含量，根据物料衡计算得出酶蛋白固定量(immobilized amount of enzyme protein, mg)，取单位质量分子筛的酶蛋白固定量为载酶量(enzyme loading, mg/g)。 　　2.4 固定化crl的泄漏 　　将上述载酶sba15移入70 ml磷酸盐缓冲溶液中，在15 ℃水浴、以150～200 r/min搅拌并定时取样，样品再以10000 r/min离心15 min，分析上清液中的酶蛋白泄漏量。 　　2.5 蛋白质定量方法 　　分别用单波长紫外分光光度法、双波长紫外分光光度法和bca法测定样品蛋白质含量。单波长紫外法公式为：c(protein)(g/l) =f×a280×d/d，式中a280为280 nm波长处吸光度，d为溶液稀释倍数，d为石英比色皿厚度(cm)，f为校正因子。双波长紫外法紫外波长下的吸光度。bca法参照美国pierce公司蛋白定量方法测定。 分 析 化 学第37卷第8期尚 雁等：介孔分子筛sba15的脂肪酶固定量分析测定 3 结果与讨论 　　3.1 蛋白质定量方法对比 　　图1表明不同浓度crl溶液在260～280 nm均有一个较强的吸收峰，该吸收峰为蛋白质芳香族氨基酸的特征峰，用于蛋白质含量测定。将粗酶浓度为6 g/l的crl溶液进行不同倍数稀释