滤膜法原理与多管发酵法的实验比较，用滤膜法测定大肠杆菌会显得.doc

濾 膜 法 原理 與多管發酵法的實驗比較，用濾膜法測定大腸桿菌會顯得比較簡單。主要的原理是將水樣經由抽氣幫浦真空抽氣，使其通過孔徑0.45±0.02μm、直徑為47mm的無菌濾膜，大腸桿菌因沒法濾過置留至於濾膜上。接著將以過濾的濾膜置於吸滿乳糖培養液或Lauryl tryptose培養液之飽和吸收墊上，在攝氏35±0.5℃恆溫下培養1.5～2小時，接著取出濾膜移至M-Endo agar培養基或M-Endo培養液的飽和吸收墊上，攝氏35±0.5℃恆溫下培養22～24小時。培養過程中，大腸菌類會分解乳糖，，產生氣體與醛類，醛類與培養（基）液中的鹼性洋紅染料結合，在光線反射下，呈現綠色金屬光澤的菌落，據此計算大腸菌類的數目。 通常濾膜總菌數在200個以下，且大腸菌數20～30個時最適宜計數，若總菌數超過200個時，可將水樣進行稀釋後在進行實驗；另檢驗濁度較高會已知有大腸菌類水樣時，可利用較小體積的水樣來進行過濾。與多管發酵法比較，此法有數優點： 濾膜法大腸桿菌群密度的計算以100ml水中總大腸桿菌落數(CFU/100ml)表示之。每張濾膜以能生約50個大腸桿菌落且總菌數以不超過200個菌落為最適宜。菌落數以下列公式計算之： 大腸桿菌群密度（CFU/100ml）＝選取的桿菌群落數*100/選取的濾水樣體積（ml） 倘若整片或部分濾膜長滿了大腸桿菌群菌落，以致無法分開計算，其結果以“大腸桿菌群呈群集生長(Confluent growth with coliform)”表示之。若群集生長者為非大腸桿菌群，也必須以“非大腸桿菌群呈群集生長”紀錄之。遇此情況，則重新採樣檢測。若由濾膜上的大腸桿菌群及非大腸桿菌群之總菌落數，超過200個或濾膜上無法明顯計數，可用“太多無法計數(Too numerous to count,TNTC)”來表示之，或另採新水樣來檢測。當重新檢測時，可將100ml之水樣分成多份分別過濾，以減少因濾膜表面菌落長的過分擁擠而造成的干擾。 這個實驗可學習如何以濾膜法檢驗待側水樣中的大腸菌類數量，由實驗中利用M-Endo agar培養基或M-Endo培養液培養大腸菌類及以大腸菌類所形成的綠金屬光澤菌落來計數。 實驗所需物品 器材：塑膠培養皿（直徑50mm）、無菌濾膜（0.450.02m）膜上應有格線、吸收墊、鑷子、定量玻璃吸管、錐型瓶、塑膠滴管、量筒、取藥杓、秤藥紙、安全吸球、酒精燈、不鏽鋼吸管筒 儀器：恆溫烘箱、電磁加熱攪拌器、電子分析天平、微風恆溫培養箱、過濾抽氣裝置、菌落計數器、解剖顯微鏡、紫外線滅菌器、無菌操作台 採集水樣：可選自來水、飲水機的飲用水、可能含大腸菌的河川水 試劑：無菌稀釋水、95％酒精、M-Endo培養基（有致癌性） M-Endo培養基分為固態與液態 固態：配置方法將51g的M-Endo agar培養基加入20ml95％酒精在加入1000ml的蒸餾水，煮沸後冷卻到45～50度。（不可使用高溫高壓滅菌） 液態：將48g的M-Endo broth培養基加入20ml95％酒精在加入1000ml的蒸餾水，煮沸後冷卻到45～50度。（不可使用高溫高壓滅菌） 本實驗使用M-Endo broth培養基，1000ml蒸餾水需48g培養基、20ml酒精，容器估算每一容器需5ml培養基，需使用6個容器，因此需要30ml培養基 48/1000：（所需培養基量）/30ml培養基 ； 20/1000：（所需95％酒精量）/30ml培養基 所需培養基量＝1.44g；95％酒精量＝0.6ml；100ml蒸餾水（依課本上的數據） 流程操作 將吸收墊置於無菌塑膠培養皿→進行M-Endo培養液或M-Endo培養基的配置→使用以過火滅菌的玻璃吸管分別吸取2ml M-Endo培養基（液）滴至吸收墊上→取一無菌濾膜放置過濾裝置，並打開開關→先以少量稀釋水將濾膜淋洗濕潤，在以20～30ml稀釋水重覆3次淋洗過濾漏斗→將濾膜放置吸收墊上→完成後放置35±1℃培養24±2小時後取出觀察→由實驗判定大腸菌類生長 步驟 1.用乾熱滅菌法將器材滅菌，並準備過濾裝置。 2.在無菌操作台將鑷子沾取95％的酒精且過火，夾取吸收墊放置塑膠培養皿中。（避免長時間打開培養皿以避免感染） 3.進行M-Endo培養基（液）配置，量秤適量培養基及酒精及蒸餾水後，在通風處用磁石攪拌器煮沸且攪拌均勻，置於無菌操作台保持無菌狀態。 4.用以滅菌的玻璃吸管分別吸取2ml滴至吸收墊上。 5.依照實驗所需的毫升數進行實驗。 6.將完成滅菌的過濾裝置、內含飽和培養基（液）吸收墊之無菌塑膠培養皿以及樣品放到無菌操作台上。 7.用沾取95％酒精過火滅菌的鑷子取一濾膜放到過濾裝置的孔平板上，將漏斗固定，打開裝置開關，以少量稀釋水（5～10ml）將濾膜淋濕，吸取待測水樣均勻散於濾膜上過