美国FDA肝素钠物种来源检测方法.docxVIP

开发一种多重实时荧光定量PCR检测法检测 原料中反刍动物DNA监测肝素钠粗品质量 深圳市倍素特科技有限公司 ? 作者 Sharla M. Peters1, Yolanda L. Jones1, Frank Perrella2, Tai Ha3, and Haile F. Yancy1 ? 1U. S. Food and Drug Administration, Center for Veterinary Medicine, Office of Research, 8401 Muirkirk Road, Laurel, Maryland 20708, USA.?2U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Office of Compliance, Silver Spring, MD 20993, USA.?3Nebraska Department of Agriculture, 301 Centennial Mall South, Lincoln, Nebraska 68508, USA. ? 摘要 开发一种实时荧光定量PCR技术检测猪源肝素钠粗品中的反刍动物源污染。该检测法由一套针对反刍动物（牛、绵羊、山羊）和猪的冻干引物、探针及内参组成。该方法经过两处分析机构验证：第一个位于FDA，第二个位于某州独立实验室。肝素钠多重实时荧光定量PCR（hMRTA）检测方法性能通过了美国FDA兽药中心研发处制定的特异性、灵敏度和专一性严格验收标准。符合早前建立的饲料中反刍动物原料多重实时荧光定量PCR检测法的灵敏度和重复性要求。hMRTA法检测猪源肝素钠粗品，?98%达灵敏度，真阳性98%、假阴性2%。PCR检测法检测三个反刍动物物种，可作为判定猪属来源的初步筛选、复查确认工具。进一步保证肝素钠粗品质量，帮助识别控制肝素钠生产来源物种。对粗品肝素钠的来源控制将保障含肝素钠药物和耗材的安全性，保护公众健康。 ? 介绍 肝素钠粗品质量监控的工业指南?（草案），旨在帮助药物活性成分、药品及医疗器械生产厂家更好地控制使用的肝素钠粗品的质量，防止OSCS或来自反刍动物的污染。要求使用者建立适当的测试方法或使用USP方法来鉴别和控制动物来源的肝素钠粗品质量。USP专论里已作出规定，肝素钠应明确标明动物种类及器官组织的来源。要求采购肝素钠粗品的药物和医疗器械厂家要对每批肝素钠粗品在生产或准备生产含肝素钠药物或医疗器械前要鉴别其物种来源。 以下测定方法使用了实时荧光定量PCR技术检测肝素钠粗品反刍动物污染。用猪源、牛源标准物评估可靠性。识别猪源肝素钠粗品中的反刍动物DNA。 操作指南提供了方法的具体细节，包括所需试剂、设备。 ? 材料及方法 建议每批待测样品（提取、纯化去杂质和PCR）都设立阴性对照。并同时给每批BioGX Ruminant and Porcine Beads设置商业化基因组DNA（牛、猪、山羊、绵羊）阳性对照。 ? 1、DNA提取 介绍: 从0.5ml干燥肝素钠粗品中提取DNA的方法描述如下：请在提取操作开始前通读整篇标准操作流程。本方法使用了Invitrogen (Carlsbad, CA)生产的ChargeSwitch? gDNA Rendered Meat Purification Kit。所有的试剂、枪头和离心管均为DNase free。?枪头需有气溶胶抗性（Aerosol resistant），减少从DNA提取到PCR扩增过程中样品之间的交叉污染。因处理的是粉状物质，建议步骤1、2带上口罩，并与DNA提取、纯化和PCR地点隔离。 注意：粗品肝素钠的PCR检测需在其它会影响DNA完整性的任何前处理（如化学氧化）前进行，以免影响PCR物种检测结果。 ? 1.1.?所需材料： 试剂盒： ChargeSwitch? gDNA Rendered Meat Purification Kit (Product #CS400-100) PowerClean? DNA Clean-Up Kit (Product# 12877-50) BioGX Ruminant and Porcine Beads (Product # 204-0002) ? 设备要求: Micro centrifuge Heat Block Nuclease Free Water Vortex Invitrogen Magna Rack 2.0 mL Tubes Smart-Cycler Smart Cycler centrifuge Smart Cycler cooling block SmartCycler 25 μL reaction tubes ? 1.2.?操