成人成骨细胞体外培养的论文.docVIP

　　成人成骨细胞体外培养的论文 关键字：成骨细胞　碱性磷酸酶　骨钙素　胶原 　　摘　要：目的：改良成人成骨细胞消化培养方法，以满足在细胞学水平进行骨代谢性疾病研究的需要。方法：取无菌骨碎片，先用胰蛋白酶消化多次，以去除血细胞和成纤维细胞；骨片经短期培养后，再次使用胰蛋白酶消化，得到大量纯净成骨细胞。细胞长至汇合后生成黑色结节。分别采用npp底物法、125i标记放射免疫(ria)法和ⅰ、ⅲ型胶原顺序沉淀抽提、sds－page还原电泳法测定细胞上清中成骨细胞主要特征性分泌物：大量碱性磷酸酶(akp)、骨钙素(o)和ⅰ型胶原。　结果：黑色结节经四环素染色，荧光显微镜下观察为骨结节特征性的金黄色。成骨细胞上清中akp分泌量为(2.76±0.56)iu/ml、o分泌量为(1.875±0.549)ng/ml，明显高于成纤维细胞(p＜0.01)。可检测到ⅰ型胶原而无ⅲ型胶原。结论：此改良方法可以在短期内得到大量性状稳定成骨细胞，同时避免成纤维细胞混入。 　　关键词：成骨细胞　碱性磷酸酶　骨钙素　胶原 　　成骨细胞特征性表型为分泌骨钙素(o)、大量碱性磷酸酶(akp)和ⅰ型胶原’而无ⅲ型胶原分泌［1］。我们采用改良骨组织消化培养方法，将骨片经短期培养后’再用胰蛋白酶消化’加快骨细胞的释放。经形态学观察及特征性分泌物检测证实’获得成骨细胞数量多，并与纤维细胞有明显区别。 　　材料与方法 　　一、液体的配制 　　0.25%胰蛋白酶用trypsin(1:250difco’detroit’michigan)溶解于d-hank’s液，抽滤灭菌。.培养液使用dmem+hamf121∶1混合液(gibcobrl’grandisland’ny)’加20%灭活新生牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml。低血清培养液为5%灭活新生牛血清，其余同培养液。使用25cm2培养瓶(nunclon’denmark)。 　　二、骨组织片消化 　　取骨科手术中获得的无菌骨碎片’彻底去除骨膜及软组织；用无菌hank′s液冲洗3次’剪碎至体积小于1mm3；hank′s液多次冲洗至骨片发白’放入锥形瓶内’加入0.25%胰蛋白酶(骨碎片10倍体积)’37℃水浴中消化(30min×5)’去掉上清。剩余骨片浸泡于培养液中’置37℃co2培养箱内2～3d后’吸出培液’加入0.25%胰蛋白酶’37℃水浴中消化30min’上清液经尼龙网过滤后’离心10min(1000r/min)’去掉上清液’沉淀物用培养液打匀’接种于25cm2培养瓶内’重复3次’直至离心后无沉淀物为止。 　　将消化后的骨片浸泡于培养液中’2～3d后’重复上述胰蛋白酶消化步骤’仍有细胞释放’根据所需细胞量’可重复数次。接种后培养瓶内培养液较浑浊’10h后即有贴壁细胞’72h后’细胞完全贴壁’可冲洗、换液。此后隔日换液。取第二、三代细胞，消化后，以1×105/ml浓度接种于培养瓶中，每瓶4ml’5d后换低血清培养液6ml，24h后收集上清液，分装于5个离心管内，-18℃保存’用于检测。 　　三、成骨细胞特征性鉴定 　　以皮肤成纤维细胞作为对照，鉴定实验所得成骨细胞。 　　1.形态学观察:除常规形态学观察外，采用趋骨性荧光素标记细胞培养生成结节。细胞培养瓶内加入四环素’使终浓度为50μg/ml’培养箱内培养1h’换新鲜培养液培养1h，经hank′s液冲洗3次’乙醇梯度脱水’固定’olympus-vanox-t显微镜落射荧光观察。 　　2.成骨细胞上清液akp检测:采用磷酸对硝基苯酯二钠盐(p-nitrophenylphosphatedisodiumsalt’npp’上海丽珠东风公司)比色法［2］’无色p-npp与akp在37℃水浴中反应生成黄色对硝基苯p-nitrophenol’经405nm波长比色’测得od值’换算成国际单位。 　　3.成骨细胞上清液中骨钙素检测:采用bgp放免试剂盒(北京东亚免疫技术研究所)检测［3］。根据放射免疫竞争结合原理，125i标记o和样品所含o与o抗体竞争结合，使用分离剂使结合抗体沉淀，4℃离心后，γ计数器测定沉淀物cpm数，根据标准品曲线得到样品o含量。 　　4.成骨细胞上清液中胶原抽提及检测:采用中性、酸性nacl溶液顺序沉淀抽提［4］，sds垂直板还原电泳法［2］。配制7.5%-0.2%bis聚丙烯酰胺凝胶板固定于垂直板电泳槽［5］。电泳液为0.05mtris、0.38m甘氨酸、0.01%sds(ph=8.8)；样品液为0.125mtris、15%甘油、2m尿素、2%sds、0.001%溴酚兰；染色液为0.25%考马斯亮蓝r250、25%异丙醇和10%hac；脱色液为5%异丙醇和8%hac。样品解冻后’放55℃水浴中变性1h’加入样品缓冲液50μl’每