慢病毒生产及使用操作手册..pdfVIP

慢病毒载体构建及包装操作手册 慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒 素抽提，共转染 293T 细胞，转染后 6 h 更换为完全培养基，培养 48 和 72h 后，分别收集 富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为 pspax2, pMD2G, pHBLVTM 系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为 DMEM(含 10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株 大肠杆菌菌株 DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞 293T 细胞的培养 （一） 293T 细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的 出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数 生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入 PBS 洗去残留的培养基； 2、加入 0.25%的胰酶，消化 1～2min 后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除 胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管 进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于 15mL 离心 管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板 中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计 数时，4 大格均计 数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即 为实 - 36 - 公司地址：上海市徐汇区斜土路 1175 号 15 楼 E-mail:service@ Tel：021 实验室地址：上海市张江高科技园区蔡伦路 720 弄张江药谷孵化器 1 号楼 314 慢病毒载体构建及包装操作手册 际 n 万/mL 细胞浓度。 4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。 5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞， 密度为 3 x 106 个/ml。 6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。 7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检 测细胞存活率，观察细胞状态等。 （二）293T 细胞的传代 当细胞生长到汇合率达到 80%～90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维 持细胞良好的生长状态。 1、消化细胞，方法同细胞冻存。 2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。 3、根据具体情况，将细胞分到 10cm 培养皿中，每个培养皿补足到 10ml 培养基。 4、将培养皿平稳放回 37℃、5%CO2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。 （三）293T 细胞的复苏 当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初 冻存的细胞进行复苏。 1、设置温度为 37～42℃的水浴。