讲稿-2.pptVIP

第二章 真核基因在大肠杆菌中的表达;（1）背景清楚，特别是对其基因表达调控的分子机制有了比较深入的了解。;二、大肠杆菌的表达载体;（1）启动子;（2）转录终止子;（3）翻译起始序列;（4）翻译增强子;（5）翻译终止密码;2、常用的大肠杆菌表达载体;TTGACA。。。。。TATAAT;三、大肠杆菌的转化方法;2、Hanahan转化法;3、电转化法; 电转化法的转化效率受电场强度、电脉冲的时间和DNA浓度等参数的影响。;? 制备用于电转化的感受态细胞相对容易。 当细菌长到对数中期，冷却、离心，然后用冷却的去离子水反复清洗，最后用10%甘油重悬细胞，使其浓度为3?1010细胞/毫升，在干冰或液氮中速冻后置于-70 ℃贮存。;四、克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达;在大肠杆菌细胞不同部位表达外源蛋白质的优缺点;* Talmadge和Gilbert（1982）将外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的不同部位表达。结果： 细胞质中表达的大鼠胰岛素原的半衰期仅有2min左右，而表达在大肠杆菌周质中大鼠胰岛素原的半衰期延长了10倍以上。（原因：蛋白酶量的差异）;2、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性;（1）蛋白质的降解作用; 为了避免在大肠杆菌中发生外源蛋白质的降解，或将此降解作用控制在最低水平，已针对性发展出了许多种不同的技术方案。主要有：;（2）结构决定因子与蛋白质的稳定性;N-端氨基酸性质;（3）表达天然的蛋白质;（4）分子伴侣（molecular chaperone）稳定作用;（5）大肠杆菌突变体菌株与蛋白质的稳定性;五、影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素;1、启动子对克隆基因表达效率的影响; 此外，两个保守序列之间的距离也影响克隆基因的表达效率，这段间隔距离越接近于17个碱基，启动子的活性就越强。;（2）启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响 ;…ACAATTTCACAGGAAACAGGATCCGGGACTATTTTACCTATGGCGGTGATAATGGTTGCATGTACTAAGGAGGTTGTATG …TGTTAAAGTGTCCTTTGTCCTAGGCCCTGATAAAATGGATACCGCCACTATTACCAACGTACATGATTCCTCCAACATAC;（3）提高克隆基因表达效率的实验方案;2、质粒载体的生物学特性与基因表达效率; 质粒的拷贝数受质粒复制控制区和宿主菌的遗传背景影响。迄今所使用的绝大多数高拷贝数的质粒载体，??是由ColE1衍生而来的。 ColE1及其衍生质粒的复制，受两种负调节成分的控制：RNAI和Rom蛋白质。; RNAI是由ColE质粒DNA编码的长度为108 nt的不翻译RNA分子，它通过干扰RNAII的加工来抑制质粒的复制。;（2）质粒载体的不稳定性对表达效率的影响; 克服质粒丢失的方法：;3、mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响;※ 连接在SD序列后面的4个碱基成分的改变，会对翻译效率发生很大影响。如果这个区域是由4个A或4个T碱基组成，其翻译最有效；而当是由4个C或4个G碱基组成，翻译效率则只及最高翻译效率的50%或25%。;(2) mRNA的稳定性对表达效率的影响; 为了维护自身的稳定性， mRNA 分子在进化过程中也形成了两种保护性结构元件：5’-UTR系列和3’-UTR系列以及顺反子间区（intercistronic region）的茎环结构。;4、遗传密码子的使用对基因表达效率的影响;造成密码子使用的偏爱性的两个原因：;（2）密码子使用的偏爱性对基因表达效率的影响;5、寄主细胞的生理状态对基因表达的影响