酶蛋白的结构.pptVIP

第三章 酶蛋白的结构 ;蛋白质结构和功能的关系;这种改变导致血红蛋白表面电荷减少，在脱氧状态下溶解度下降，发生不正常聚集，形成镰刀状红细胞，严重时造成红细胞破裂。血红蛋白分子共有574个氨基酸残基组成，仅仅两个β亚基上各改变了一个氨基酸残基，生理功能就发生了如此大的变化，可见蛋白质的一级结构对功能的影响之大。 ;牛胰核糖核酸酶复性实验 8个Cys－SH形成4个二硫键的组合方式有7×5×3=105种，因而重新形成正确配对的概率仅1/105， ;第一节 蛋白质一级结构研究方法 ;1. 蛋白质的分离纯化和相对分子质量的测定 电泳单一带 SDS测分子量（质谱法） ;2.确定蛋白质分子中多肽链的数目 末端分析法 3. 拆分并分离蛋白质分子的多肽链 氧化法 氧化法的优点在于二硫键一旦拆开，不会重新形成连接，但在氧化过程中伴随着一些副反应，Met侧链被氧化生成亚砜，Trp侧链被破坏。 还原法 为了防止游离巯基重新氧化，还需加入烷化剂如碘乙酸，使巯基上发生取代反应而不会重新被氧化 ;4. 测定每条多肽链的氨基酸组成 蛋白质完全水解：要求完全水解且不破坏氨基酸 1）酸水解： 作水解程度时间图确定最佳时间 1-10mg蛋白样品 → 加HCl → 抽真空 → 封闭 → 烘箱 特点：a）Trp完全破坏，生成不溶性物质 b）? Ser、Thr、Tyr部分破坏，Ser破坏10-15%，Thr、Tyr破坏5-10%，应予以校正 c）? Asn → Asp Glu → Gln d）? 胱氨酸→半胱氨酸 e）? 大部分氨基酸不破坏;2）碱水解： 特点：a)Trp不破坏 b）大部分氨基酸破坏 ;分离检测：1）纸层；2）薄层；3）离交；4）氨基酸自动分析仪 ;5. 多肽链的N-末端和C-末端分析 目的：有几条肽链；N、C末端是何氨基酸 测不出末端的几种原因：蛋白质分子为环肽；末端被保护试剂保护；末端是Pro 5-1 N端测定（介绍原理、分离检测方法和优缺点） 1）FDNB法（Sanger法；2.4-二硝基氟苯法） a）原理： ;b) 分离检测：乙醚萃取，DNP-Aa溶于乙醚而Aa不溶 标准Aa + DNP——反应——纸层——喷茚三酮 未知DNP-Aa-——纸层——喷茚三酮 比较即得结果，若结果是两点以上则证明是有几条肽链组成 c）优点：???应条件温和，末端产物易分离 缺点：N端是Pro测不出；不能进行N端测序 Lys的另一氨基生成e-DNP-Lys，由于它不溶于乙醚故不影响测定结果;2) 丹磺酰氯法（DNS法） a) 原理： ;b）分离检测：DNS-Aa溶于乙酸乙酯，Aa不溶 标准Aa + DNS——反应——纸层——荧光显色 未知DNS-Aa-——纸层——荧光显色 比较即得结果，若结果是两点以上则证明是有几条肽链组成 c）优点：灵敏度高；是前种方法的100倍；用量少，样品量为0.1-2ng 缺点：DNS-Pro、DNS-Try被破坏；N端是Pro、Try测不出；不能进行N端测序 ;3) Edman降解法[苯异硫氰酸酯法（PITC法)] a) 原理： a）分离检测：PTH-Aa溶于乙酸乙酯、丁酸乙酯，Aa不溶 c）优点：N端是Pro可测；能进行N端测序 缺点：灵敏度稍差 ;4）DansyCl-Edman法 既可检测N端序列又有较高灵敏度 ;5) 亮氨酸氨肽酶法 此酶专一水解N端羧基形成的肽键，可测N端序列，但不能测N端为Pro. ;5-2 C-末端分析 C-末端分析方法也有很多，但至今还不能令人满意，常用的有肼解法、还原法、羧肽酶法等。 1）肼解法 原理： ;b）分离检测： 苯甲醛+酰肼→沉淀→离心 上清液中含游离基酸 2) 还原法 用还原剂如硼氢化锂处理肽链，则C-末端残基的α-羧基被还原成醇，将肽链完全水解后，分析水解产物，其中的α-氨基醇对应的即为C-末端氨基酸。 ;3) 羧肽酶法 羧肽酶是一种专一从多肽链的C-末端开始逐个水解氨基酸残基的蛋白水解酶。由于该酶的专一性，当它作用于多肽链时，C-末端残基首先被水解下来，然后是C-末端第二个氨基酸残基，依此类推。根据氨基酸释放的动力学曲线，可以确定C-末端氨基酸以及靠近C-末端的几个氨基酸的排列顺序。不过这是理想的情况，实际测定中常常有多种因素干扰，很难确定C-末端多个氨基酸的排列顺序。 羧肽酶A：a）Lys、His、Arg在C-末端不能水解 b）C-末端是Pro不能水解 c）C-末端第二个是Pro，无论第一个是何氨基酸都不能水解 羧肽酶B：a）水解C-末端为Lys、His、Arg的 b）C-末端第二个是Pro，无论第一个是何氨基酸都不能水解 ;6.多肽链的局部断裂和肽段的分离 在氨基酸顺序测定时，只要从