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大肠杆菌感受态细胞制备与转化 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 　　1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 　　2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 　　3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 　　4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 　　本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。 　　本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。?? 同时做两个对照: 　　对照组1: 以同体积的无菌双???水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 　　对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 　　四、 计算转化率 　　统计每个培养皿中的菌落数。 　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg) 　　感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数 [注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。 思考题 　1. 制备感受态细胞的原理是什么？ 2. 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？ 二、大肠杆菌作为基因工程宿主菌的优越性和局限性 1、优越性： （1）大肠杆菌是迄今为止研究得最详尽的原核生物 （2）已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各种宿主菌和载体 （3）培养简单，繁殖迅速，培养代谢易于控制，易于进行工业化批量生产 （4）实验已经证明，许多克隆的真核基因，如生长激素基因和胰岛素基因等，都可在大肠杆菌中实现高效表达 2、局限性： （1）不具备真核生物的蛋白质复性系统 （2）缺乏真核生物蛋白质加工修饰系统 （3）内源蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定 （4）细胞膜间隙含有大量内毒素，可导致人体热原反应 三、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法 1、CaCl2法 （1）CaCl2法是制备大肠杆菌感受态细胞最常用的化学方法。 （2）优点：易操作，费用低，无需特殊设备。缺点：所制备的感受态细胞转化率低。 （3）原理：将快速生长的大肠杆菌细胞置于经低温（0℃）预处理的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，易与外源DNA黏附并在细胞表面形