水华微囊藻分离和其鉴定技术研究进展.docVIP

水华微囊藻分离及其鉴定技术研究进展 聂晶晶1 ，铁程2 ，金玉2，殷丽萍2，李元1 ，杨良 2 摘要：我国是蓝藻水华分布最广，受影响最大的国家之一。水华的普遍发生，使水体的感官性状恶化，水体自净能力降低。有毒蓝藻的研究也是目前热点之一；微囊藻毒素(Microcystins，MC)是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。对其研究十分必要。但在微囊藻分离培养以及分离后纯种的鉴定研究方面还存在许多难点。本文介绍近几年来在水华蓝藻分离培养和鉴定技术方面的研究进展。 关键词：分子鉴定 蓝藻 水华 分离 培养 前言：湖泊、水库和河流中接纳过多的氮和磷等营养物质，使水体的生态结构与功能发生变化，导致藻类特别是蓝藻(Cyanobacteria)的异常繁殖生长而出现的蓝藻水华现象。当蓝藻水华严重时，水面形成厚厚的蓝绿色湖靛，散发出难闻的气味。不仅影响人的感官、破坏了健康平衡的水生生态系统，而且因藻细胞破裂后释放出了多种藻毒素而对人和动物的饮用水安全构成了严重的威胁。世界上25％～70％的蓝藻水华污染可产生藻毒素，在已发现的各种不同藻毒素中，微囊藻毒素(Microcystins，MC)是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。纯种藻的分离和培养十分必要，然而藻类的分离培养有很多因素制约，如藻细胞普遍比较小，而且很多藻细胞聚集在一起也对分离造成了很多的困难。很多科研单位从藻种提供单位购买，不仅增加了研究支出，而且特异性的地区藻类的进化和遗传有很大差异。科研单位有必要独立解决藻类的分离培养技术。分离培养的纯种藻需要定性说明是什么藻，所以藻的鉴定也是十分必要的。 1. 藻类分离培养 藻类的分离方法就是为了提供纯种藻作为基础和应用研究的材料，也是今后开展藻类增长潜力试验(简称AGP试验)不可缺少的手段之一。藻类培养首先要有藻种。从天然水域的混杂生物群中，用一定方法把所需藻类个体分离出来，而获纯种培养。这种方法称为藻种分离和纯化，又称纯培养法。真正的“纯种培养”是指在排除包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培???。这是进行科学研究不可缺少的技术，而在生产性培养中不排除细菌的称之为“单种培养”。要想从水体中分离出试验所需的纯种藻必须经预备培养；藻种分离；纯种培养；保种这四个步骤。 1.1 藻种分离 细胞藻类的分离方法按照培养载体分为：固体培养基法、液体培养基法。 1.1.1 固体培养基法 (1) 半固体稀释倒平板法： 先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释，然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至35℃左右的琼脂培养基（200 mL培养基加入0.5g琼脂）混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含藻的琼脂平板，保温培养一段时间后可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或者琼脂培养基中就可出现分散的单个藻种，然后挑取该单个藻株，或重复以上操作数次，便可得到纯的单种藻。 (2) 涂布平板法[1]： 由于将含藻材料先加到较热的培养基中再倒平板易造成某些热敏感的藻类死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些 严格好氧的藻类被固定在琼脂中因缺乏氧气而影响生长，因此更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已溶的培养基倒入无菌培养皿中，冷却后将一定量的某一稀释度的样品悬液滴在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将藻液均匀分散至整个平板表面；还有种做法是把稀释藻液装入消毒过的小型喷雾器中（如医用喉头喷雾器），打开培养皿盖，把藻液喷射在培养基平面上，形成分布均匀的薄层水珠。经培养后挑取单个藻株。 (3) 平板划线分离法： 用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，以无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐渐分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分开，经培养后，可在平板表面得到单种。 1.1.2 液体培养基 对于有些藻类用固体培养基分离效果通常是满意的，但是有些藻类需要用液体培养基分离来获得纯培养。培养微囊藻常用液体培养基有HGZ、MA[2]、BG11等。单细胞藻类单种液体培养基分离常用下列三种方法：微吸管分离法，水滴分离法，稀释分离法[3]。 (1) 微吸管分离法： 将稀释适度的藻滴水样，滴于凹玻片上。在显微镜下用微吸管挑选要分离的藻体， 认真仔细地吸出放入另一个凹玻片上，在显微镜下观察该滴藻液中是否达到纯分离目的，如不成反复几次，直至达到分离目的为止。然后移入经灭菌的培养液中(一般在20mL试管中装入培养液2～4mL)进行培养。此法操作技术要求高，要细心。往往吸取一个细胞，要反复几次才能成功。因为微囊藻个体较大，一般这种方法比较常用，但对操作者要求较高。 (2) 水滴分离法： 用微吸管吸取稀释适度的