蛋白质、氨基酸、糖的鉴别试验和其比较.doc

蛋白质 1.由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。 2.双缩脲反应biuret reaction：蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用形成紫色络合物的呈色反应。在540nm 波长处有最大吸收。可用于蛋白质的定性和定量检测。 　 HYPERLINK /image/b25aae51c8bc403f377abe6a \o 查看图片 \t _blank ?? 紫色络合物分子结构式 在碱性溶液（NaOH）中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与铜离子（Cu2+）作用，形成紫色络合物（该物质的分子结构式见图），该反应即双缩脲反应。 　　双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一种 HYPERLINK /view/1683376.htm \t _blank 颜色反应。一般分子中含有两个氨基甲酪基（即肽键：-CO-NH-）的化合物与碱性铜溶液作用，就会形成紫色或蓝紫色络合物。 　　注：除-CO-NH-有此反应外，（-CONH2-）、（-CH2-）、（-NH2-）、（-CS-CS-NH2）等基团亦有此反应。 双缩脲反应的鉴定 　　由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用 HYPERLINK /view/585487.htm \t _blank 双缩脲法测定蛋白质的含量（借助分光光度计可减小误差）。 　　双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是精确度低、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如Tris缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。 配制双缩脲试剂的注意事项 双缩脲试剂由NaOH溶液（0.1g/mL）和CuSO4溶液（0.01g/mL）配制而成，配制比例为5:1。但是双缩脲试剂不用现配现用，这是与斐林试剂不同的地方之一！ 蛋白质检测方法比较 ???法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法灵敏度低，使用于0.2-1.0mg氮，误差为±2%费时，8-10小时，但如果采用凯氏定氮仪，缩短时间至4个小时将蛋白氮转化为氨气，然后用酸吸收滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定，干扰少，费时，如果采用凯氏定氮仪，就会大大缩短定氮时间 双缩脲法灵敏度低，1-20mg中速20-30分钟多肽键+碱性Cu2+紫色络合物硫酸铵：Tris缓冲液，某些氨基酸用于快速测定，但不灵敏，不同蛋白质显色相似 紫外吸收光法较为灵敏，50-100微克快速5-10分钟蛋白质中的络氨酸和色氨酸残基在280nm处有紫外光吸收各种嘌呤和各种核苷酸用于层析柱流出液的检测，核酸的吸收可以校正 考马斯亮蓝法灵敏度最高，1-5微克快速5-15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（ 特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色其λmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液，TritonX-100SDS最好的方法，干扰物质少，颜色稳定，灵敏度高颜色深浅随不同蛋白质变化 Folin酚试剂法灵敏度高，5微克慢速40-60分钟双缩尿反应，磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵，Tris缓冲液，甘氨酸，各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化 氨基酸 茚三酮鉴别试验的反应方程式： 氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。脯氨酸为黄色化合物，谷丙酰胺和天冬酰胺为棕色化合物。 糖分的鉴别实验 Fehling试验?生药的水浸液加Fehling试剂，于沸水浴加热数分钟，若有还原性糖类成分存在，则产生砖红色氧化亚铜沉淀。若有非还原性低聚糖及多糖存在，则必须加稀酸水解后，才能与Fehling试剂呈阳性反应。糖类包括多糖、寡糖、单糖，其中单糖和某些二塘具有有力羰基，是还原糖，多糖和蔗糖没有还原性。  HYPERLINK /s/?w=%E6%96%90%E6%9E%97%E8%AF%95%E5%89%82ch=link \t /z/_blank 斐林试剂是新配制的溶液，它在加热条件下与 HYPERLINK /s?q=%