摇瓶种子的制毙赂及菌种的保藏 2.ppt

主题二 摇瓶种子的制备及菌种的保藏;带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置 ;第三节 摇瓶种子的制备;1.摇瓶种子的制备工艺; （2）培养基配制 摇瓶种子以培养具有强生长活性的营养菌体为目的，因而在配制培养基时必须全面、均衡地满足菌体生长对各种营养物质的要求，包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等。 摇瓶种子在培养过程中一般不便于调节pH，故在培养基成分的选择时还应考虑培养过程中pH的稳定，可以通过生理酸、碱性物质的平衡搭配及加入磷酸盐、碳酸钙之类缓冲剂来实现。 分装培养基的三角摇瓶用棉塞或泡沫塑料塞口，置高压蒸汽锅内灭菌。 灭菌结束后要缓慢降压，以免培养基暴沸冲湿塞子。; (3)接种 摇瓶种子的接种一般采用斜面种子挖块法或米孢子粒计数接人法。 这种接种法难于掌握一致的接种量，可能影响摇瓶种子质量的稳定。 对接种量敏感的菌种，最好采用悬液接种法，即用无茵蒸馏水将斜面种子或米孢子粒上的细胞或孢子洗下，制成细胞或抱子悬液，然后按一定体积或一定细胞(孢子)数接种至摇瓶种子培养基中。 ;(4)培养 摇瓶种子在恒温室内的摇床上进行培养。摇床分旋转式和往复式两种。 抗生素工厂常用的是旋转式。 这种摇床由于主动轴和从动轴之间有一个偏心距(一般为25～50mm)，从向而旋转中产生振荡作用，以利于培养时气体交换。 为了使摇瓶中的水分蒸发量保持稳定，恒温室也应控制一定的湿度。;(5)保存 摇瓶种子应当在培养成熟后立即使用。如果暂时不用，可置4℃冰箱中保存，保存期最好不超过3d。 经过保存的摇瓶种子一般不用做生产种子，可用于摇瓶发酵实验或小型发酵罐实验。;2．摇瓶种子的质量标准;(1)菌体浓度;（2）菌体生长阶段 ;3.影响摇瓶种子质量的因素及其控制;（1）培养基组成;（2）摇瓶装量;（3）摇床转速;（4）摇瓶在摇床中的位置 ;4．孢子接入量;第四节 菌种保藏;一、理想的菌种保藏方法应具备的条件;二、工业微生物菌种保藏技术;(一) 冷冻保藏 ;冷冻保藏种类 ;1.普通冷冻保藏技术(-20℃);应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。 保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。 这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。 ;2.超低温冷冻保藏技术(-60～-80℃);如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获。 超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1 ～ 2℃／min。 若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。;3.液氮冷冻保藏技术 ;(2)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 ① 冷冻保藏菌种悬液的制备 a.从生长斜面制备菌悬液： 每一斜面加入5ml含10％甘油的营养液体培养基；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶， ; b.从浸没培养物制备菌悬液： 在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散； 0.5 ～ lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口； 将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。 ; ②控速冷冻 a.将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中； b.将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中； c.以1 ～ 2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)； d.补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；;e.细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃； f.将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或 气相(-156℃)中保存。 如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。 ;③复苏 a．从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中； b．迅速将安瓿置于37 ～ 40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解； c．用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1 ～ 0.2ml (约4、8滴)转接入琼脂斜面上。;4. 冻干保藏 ;培养物的冻干过程;(1)操作步骤 ①启动冷冻干燥器的致冷单元。当冷凝器的温度达到-40℃时启动真空泵，使真空度达到2.67～4.00Pa。 ②将冷冻槽置于歧管之下方。槽中装入2／3体积的异丙醇，然后插入温