丹酚酸B干预内皮祖细胞对骨髓间充质干细胞向心肌分化早期基因表达的影响.docVIP

　　丹酚酸B干预内皮祖细胞对骨髓间充质干细胞向心肌分化早期基因表达的影响 作者：李庆雯 谭俊珍 南亚昀 范英昌 【摘要】 目的 探讨中药丹酚酸B预处理的内皮祖细胞（EPCs）对急性心肌梗死(AMI)大鼠移植骨髓间充质干细胞（BMSCs）向心肌分化早期基因表达的影响。方法 密度梯度离心法和贴壁筛选法培养、纯化EPCs与BMSCs；免疫细胞化学法（CD34/CD133/CD44）分别鉴定两种细胞。结扎大鼠左冠状动脉，制作大鼠AMI模型，42只大鼠随机分为假手术组，模型组，BMSCs组，EPCs+BMSCs组，其中 治疗 组用丹酚酸B最佳药物浓度处理的EPCs与BMSCs混合，在大鼠AMI区周边分五点注射。RTPCR检测心肌分化早期基因Nkx2.5、GATA4表达。结果 细胞移植4 esenchymal stem cells on gene expression in rats′ models of acute myocardial infarction(AMI). Methods Cultivation and purification of EPCs and BMSCs in vitro ethod, and munofluorescence and immunocytochemistry (CD34/CD133/CD44). The rat model of AMI ly by model, sham, BMSCs and EPCs bined ia area. After 4 ined by realtime PCR. Results The expression of NKx2.5 and GATA4mRNA arkably pared prove the cardiac function. 　　【Key esenchymal stem Cells (BMSCs); Acute myocardialin infarction (AMI) 　　移植的干细胞能在受损心肌部位分化成为新的心肌样细胞〔1，2〕，而骨髓间充质干细胞（BMSCs）因自体来源，取材容易，扩增能力强，成为研究热点。目前研究主要集中在通过药物诱导来提高间充质干细胞（MSCs）移植后的存活和定向分化〔3，4〕。本文前期的研究结果表明丹酚酸B(SalB)可以减小心肌梗死的面积〔5〕,促进心脏功能的恢复。内皮祖细胞(EPCs)是血管内皮的前体细胞，移植后促进缺血性疾病的血管再生和侧支循环建立已被证明〔6〕。因此本文采用SalB预处理EPCs，与BMSCs联合移植，观察急性心肌梗死（AMI）大鼠模型BMSCs向心肌细胞分化过程中早期基因Nkx2.5、GATA4的表达情况。 　 　1 资料与方法 　　1.1 材料 LDMEM (美国Gibco公司)；特级胎牛血清（美国Hyclone公司）；血管内皮生长因子（VEGF）,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），纤维连接蛋白(R＆D公司)；大鼠单个核细胞分离液（天津灏洋）；5％CO2恒温培养箱（model TC2323 CO2 incubator）；CD34兔多克隆抗体，CD44兔多克隆抗体(武汉博士德），CD133兔多克隆抗体（天津灏洋）；SalB（天津天士力 现代 中药资源有限公司，批；ABI7300实时定量PCR仪；逆转录试剂盒、SYBR(R) Premix Ex TaqTM（宝生物工程（大连）有限公司）；Trizol总RNA提取试剂（天津润泰科技 发展 有限公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 EPCs培养与鉴定 贴壁培养和密度梯度离心结合法：雄性EM（含体积分数为15%胎牛血清，15%VEGF，15% bFGF），置于37℃，5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，4 d后首次换液，继续培养至第7天。选取生长良好的培养至7 d的EPCs，用SABC法检测细胞表面抗原CD34、CD133。CD34、CD133定位于细胞膜及细胞质。以细胞膜和细胞质出现棕黄色、高出背景色者为阳性细胞。 　　1.2.2 BMSCs培养与鉴定 贴壁培养和密度梯度离心结合法：雄性EM离心洗涤后以3.0×105/cm2的密度接种于DMEM（含10%胎牛血清），置于37℃，5% CO2饱和湿度的培养箱中继续培养，48 h后首次换液，以后每3 d更换一次培养液。2 l共10组，MTT方法分别测定细胞的吸光度（OD）值，根据OD值均数确定SalB的最佳药物浓度。 　　1.2.4 大鼠AMI模型的制作 冠状动脉结扎法，乙醚麻醉后将大鼠固定于手术台，颈部胸部备皮、消毒，铺无菌孔巾，在胸部左侧约0.5 cm处第4、5肋间切开皮肤，剪开心包，暴露心脏，以左冠状动脉主干为标志，在左心耳根部下方2 mm结扎左冠状动