二氮嗪预处理对缺氧复氧后大鼠海马神经元凋亡及JNK表达的影响.docVIP

　　二氮嗪预处理对缺氧复氧后大鼠海马神经元凋亡及JNK表达的影响 作者：刘荣国， 崔翔， 宋娜， 陈彦青 【摘要】 目的 探讨二氮嗪(DZ)预处理能否抑制CJun氨基末端激酶(JNK)表达而减轻缺氧复氧后大鼠海马神经元的凋亡。 方法 原代培养9～10 d的SD大鼠海马神经元随机分为5组：对照组、DZ 0，30，100 μmol/L和DZ 100 μmol/L+5羟癸酸(5HD)100 μmol/L预处理组。除对照组外，其余4组神经元自缺氧前2 d开始，每天实施以上对应浓度DZ预处理1 h，连续3 d。于体外缺氧4 h复氧48 h后，采用四唑蓝比色法测定海马神经元活力，AnnexinⅤFITC流式细胞术测定凋亡率，itochondrial ATP Sensitive Potassium Channel, MitoKATP)开放剂可模拟缺血预处理，激发脑的内源性保护机制而增强抗损伤效果[12]。脑损伤患者的愈后与凋亡密切相关。cJun氨基末端激酶 (cJun Nterminal kinase，JNK)是有丝分裂原激活蛋白激酶超家族成员之一，具有促凋亡和抗凋亡的双重功能，发挥哪一功能受到细胞类型、刺激方式、持续时间以及其他信号的影响，在离体培养大鼠海马神经元缺氧实验中，JNK信号主要发挥促凋亡作用[34]。本研究以原代培养的大鼠海马神经元为实验对象，探讨DZ预处理能否抑制JNK信号蛋白表达而减低缺氧复氧后大鼠海马神经元的凋亡，旨在进一步了解药物预处理的抗损伤机制。 　 　1 材料与方法 　　1.1 主要药品、试剂和仪器 二氮嗪(批号：022K1516)、5羟癸酸(5Hydroxydecanoate，5HD，批号：057H5076)购自美国Sigma公司;Annexin ⅤFITC试剂为美国BD公司产品;多克隆兔抗大鼠JNK抗体(FL型SC57)、山羊抗兔IgG抗体购自美国Santa cruz公司。密闭缺氧装置为北京通达科技公司产品;电泳仪(MiniProtean3，美国Amersham Biosciences公司);酶标仪(Model 550，美国BioRad公司);凝胶成像系统(Gel Doc XR+，美国BioRad公司);流式细胞仪(FACS Calibur，美国BD公司)。 　　1.2 方法 　　1.2.1 大鼠海马神经元原代培养和鉴定 取新生SD大鼠〔出生时间lt;24 h，5～6 g，二级，上海实验动物中心提供(许可证号：SCXK沪20070005)〕，经消毒、断头后分离出海马，切碎并移入0.125%胰蛋白酶溶液中消化30 min。终止消化，吹打细胞悬液，以5×105 mL1的细胞密度接种于直径35 mm培养皿或96孔板中，每皿2 mL或每孔100 μL，置于37 ℃、体积分数为0.1的CO2培养箱中培养，9～10 d后行实验。神经元鉴定方法为：培养至第9天，应用神经元特异性烯醇化酶(Neuron Specific Enolase,NSE)免疫细胞化学染色，海马神经元细胞质和突起被染成棕褐色，为阳性细胞;未被染色的细胞为阴性细胞。 　　1.2.2 实验分组、缺氧方法和DZ预处理方法 大鼠海马神经元分为对照组(A组)、DZ 0 μmol/L组(B组)、DZ 30 μmol/L组(C组)、DZ 100 μmol/L组(D组)、DZ 100 μmol/L+5HD 100 μmol/L(E组)。每次实验每组采用12孔或2皿，实验重复3次。除对照组外，其他组于缺氧前2 d开始，每天实施以上对应浓度DZ预处理，每次1 h，随后培养液全量置换，连续3 d。将海马神经元置入密闭缺氧装置中后，充体积分数为0.95的N20.05的CO2气体4 h，流速为0.2 L/min，以造成缺氧环境，于复氧48 h测定相关指标。 　　1.2.3 四唑蓝比色法测定神经元活力 96孔板之每孔中加入5 mg/mL四甲基偶氮唑蓝磷酸缓冲液10 μL，继续培养4 h后弃去上清液，再加入100 μL二甲基亚砜均匀振荡10 min，在酶标仪(测量波长600 nm)上读取数值为吸光度值，以吸光度值表示海马神经元的活力。 　　1.2.4 Annexin VFITC法检测神经元凋亡率 海马神经元按以下程序处理：0.1 mol/L PBS漂洗后，0.125%胰蛋白酶消化5 min，终止消化后制备单细胞悬液，收集细胞并离心(1 000 r/min)5 min，弃去胰蛋白酶后，0.1 mol/L PBS漂洗2次，以含Ca2+缓冲液将神经元浓度稀释为1×106 mL1，加Annexin V(1∶20)避光反应10 min，再以PI(1∶20)标记后，立即在流式细胞仪上测定凋亡率。 　　1.2.5 arker 10 μL，