免疫亲和柱净化—液相色谱—串联质谱法测定海洋生物中河豚毒素.docVIP

　　免疫亲和柱净化—液相色谱—串联质谱法测定海洋生物中河豚毒素 免疫亲和柱净化液相色谱串联质谱法测定海洋生物中河豚毒素 1 引 言 　　河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）是一种天然海洋生物神经毒素，分布广泛，主要存在于河豚鱼中，圆尾鲎、蓝环章鱼、螺类等其它海洋生物中也有存在。河豚毒素毒性极强，食用0.5 mg就可致人死亡，其带正电荷的胍基能伸入钠通道的离子选择过滤器，和通道内壁上的游离羧基结合，阻碍Na+进入，从而抑制神经冲动的传导，使人感觉神经麻痹，四肢瘫痪，呼吸困难，最后因呼吸抑制而死亡。我国每年都有因食带有TTX的海洋生物而导致中毒的事件发生。鉴于河豚毒素的严重危害，有必要建立一种简便、快速有效检测河豚毒素的方法。 　　目前，河豚毒素的检测方法有生物测定法、高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱串联质谱法（LC-MS）及酶联免疫法（ELISA）等。其中，生物测定法一般需要专门动物，适用性差，且操作繁琐，费时费力重复性差；酶联免疫法虽特异性强，但酶联免疫反应耗时长，操作难度较大；液相色谱串联质谱法灵敏度高，但现有的TTX分子结构中具有带正电荷的胍基，本实验选择在正离子扫描模式下用蠕动泵以3.0 mg/L的TTX标准溶液进行流动注射分析，对质谱参数进行优化。通过一级质谱扫描分析，得到TTX的分子离子，调试选择最佳锥孔电压和毛细管电压，其中+ （m/z 320）丰度最高，从而可选择离子m/z 320作为母离子进行检测，如图1所示。对分析物离子进行二级质谱分析，获取碎片离子信息，并对碰撞能量等质谱参数进行优化，见表1。 　　3.2 提取试剂的选择 　　TTX是一种氨基全氢喹唑啉型化合物，只溶于酸性水或有机溶液。本实验比较了乙腈和甲醇对TTX的提取效率。乙腈作为常用的提取试剂，提取效率较好，但毒性较大；考虑到甲醇能迅速穿透组织，沉淀蛋白质，并具有脱水性，是提取TTX的良好试剂。为考察TTX提取所需的合适酸度，通过添加不同体积分数的乙酸获取不同酸度的甲醇，比较不同酸度甲醇下提取 　　图2 提取试剂酸度对TTX提取效果的影响 　　Fig.2 Effect of extraction reagent acidity on TTX extraction 　　得到的5 mu;g/L TTX峰面积，结果如图2所示。当提取试剂中乙酸体积分数小于1%时，提取得到的TTX峰面积随乙酸的体积分数增加而增大；当体积分数大于1%后，峰面积基本保持不变，而过量的乙酸不利于调节样品液pH值，因此选择含1%乙酸甲醇作为TTX提取试剂。 　　3.3 免疫亲和柱条件优化 　　免疫亲和柱的亲和结合作用与样品液的pH值直接相关，不适宜的pH值会使亲和作用减弱或破坏。本实验采用HCl和NaOH调节样品液pH值，通过比较不同pH值下TTX的回收率，考察不同pH值下免疫亲和柱的亲和作用能力，结果如图3所示。当pH=7～8时，亲和作用能力最佳，TTX回收率最高；当pHlt;6.5或pHgt;9时，亲和能力明显减弱，由此确定pH=7～8时为TTX免疫亲和柱的最适宜pH值。 　　当使用8 mL水淋洗亲和柱时，杂质可基本除去，而TTX未被洗脱下来； 　　TTX几乎已完全洗脱，回收率也趋于稳定。因此本实验采用8 mL水作为淋洗液，4 mL含有1%乙酸甲醇作为洗脱液。 　　本实验还比较了MCX柱、C18柱、SCX柱与免疫亲和柱对海洋生物的净化效果，并考察4种层析柱对TTX回收率的影响。实验结果表明，免疫亲和柱对海洋生物样品的净化效果最好，目标峰能与杂峰有效分离，且响应强度高，回收率好，如图4所示。 　　3.4 线性范围和定量限 　　用TTX标准使用液配制浓度为0.3， 1.0， 2.0， 5.0， 10.0和20.0 mu;g/L标准工作溶液，峰面积-TTX浓度标准曲线的线性回归方程为y=72.2835x+13.5344（R2=0.9972），TTX在0.3～20.0 mu;g/L范围内线性良好。以3倍信噪比确定本方法的检出限（LOD）为0.1 mu;g/kg，以10倍信噪比确定本方法的定量限（LOQ）为0.3 mu;g/kg，如图5所示。本方法较