凝血酶预处理对海马神经元的保护作用.docVIP

　　凝血酶预处理对海马神经元的保护作用 作者：杨文琼,孙圣刚,童萼塘 　[摘要]　　目的: 研究 凝血酶预处理（TPC）对大剂量凝血酶（TM）诱导海马神经元凋亡的 影响 ，阐明TPC的保护作用。 方法 :海马神经元分别经生理盐水（Sham组）、小剂量TM（TPC组）及凝血酶受体激活肽（TRAP组）预处理48 h后再加大剂量TM作用24 h。TUNEL法及流式细胞术检测凋亡细胞数和凋亡百分率， 应用 免疫细胞化学方法检测神经元Bcl-2及Bax蛋白表达。结果:与Sham组比较，TPC组TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率明显降低（Plt;0.01），Bcl-2表达上调，Bax表达明显下调（Plt;0.01）。与Sham组比较，TRAP预处理组TUNEL阳性细胞数和凋亡百分率明显降低（Plt;0.01），Bcl-2表达上调，Bax表达明显下调（Plt;0.01）。TRAP预处理组与TPC组相比差异无显著性（Pgt;0.05）。结论:TPC可抑制TM导致的神经细胞凋亡，激活PAR-1，促进Bcl-2的表达和降低Bax的表达，可能是TPC抑制细胞凋亡的机制之一。 　　[关键词]　　凝血酶预处理；细胞凋亡；Bcl-2；Bax；蛋白酶激活受体-1 　　 The Effect of Thrombin Preconditioning on the Apoptosis of Hippocampal Neurons 　　 　　Abstract:Objective To investigate the effect of thrombin preconditioning（TPC）on the apoptosis of hippocampal neurons and explore the potential mechanisms. Methods Hippocampal neurons l TM and 5μmol/L thrombin receptor activating peptides（TRAP）for 48h before exposed to 40U/ml TM,respectively.The number of apoptotic cells and apoptotic rate of neurons easured by terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) mediated dUTP-biotin nick end-labeling（TUNEL）method and Floetry.Bcl-2 and Bax protEin expression easured by immuocytochemical method.Results The number of apoptotic cells and apoptotic rate of neurons group,the number of apoptotic cells and apoptotic rate of neurons echanism of neuroprotective effect of TPC may be through activating PAR-1,up-regulating Bcl-2 protein expression and dobin preconditioning;Apoptosis;Bcl-2;Bax;Protease activated receptor-1 　　作为血肿成分中最特殊的物质，凝血酶在脑出血脑损伤中的作用倍受关注[1]。研究发现，虽然大剂量凝血酶可导致脑损伤和细胞凋亡，但低浓度的凝血酶却具有神经保护作用。经过小剂量凝血酶预处理后，凝血酶和脑内血肿所致的脑水肿可减轻，大鼠大脑中动脉梗塞模型中的梗塞面积明显减小[2,3]，这种现象被称为凝血酶预处理（Thrombin Preconditioning,TPC）或凝血酶诱导的脑耐受。为了探讨凝血酶预处理的神经保护机理，本实验采用小剂量凝血酶预处理原代培养的海马神经元，结合TUNEL法、流式细胞术及免疫细胞化学等方法，研究凝血酶预处理的保护作用及其机制。 　　1　　材料和方法 　　1.1　　材料新生SD大鼠80只(华中 科技 大学同济医学院实验动物中心提供),凝血酶（Sigma公司）,凝血酶受体激活肽（TRAP，武汉协和 医院 心血管研究所合成），DMEM培养基,B27促生长剂（Gibco），神经元特异性烯醇化酶（NSE），Bcl-2、Bax小鼠单克隆抗体（Santa Cruz）,TUNEL试剂盒（Roche公司）,SP免疫组织化学试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。 　　1.2　　方法 　　1.2.1　　新生大鼠海马神经元