慢病毒载体介导的shRNA对小鼠T细胞CD28基因表达的影响.docVIP

　　慢病毒载体介导的shRNA对小鼠T细胞CD28基因表达的影响 作者：程娜娜，桑威，陈翀，徐开林 【摘要】 目的 探讨编码针对小鼠CD28的短发卡状RNA(short hairpin RNA, shRNA)的慢病毒载体对小鼠T细胞CD28基因表达的影响。方法 设计并合成3对靶向小鼠CD28的特异性干扰序列和1对非特异性干扰序列，亚克隆入慢病毒载体pLB中，构建出重组慢病毒干扰质粒，行PCR鉴定并进一步测序证实。分别将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞, 生产慢病毒颗粒, 并依据绿色荧光蛋白(GFP)表达水平检测病毒滴度。慢病毒感染小鼠脾淋巴细胞，实时荧光定量RT-PCR和ethods Three pairs of specific interference sequences targeting CD28 gene and one pair of non-specific RNA interference sequences of U6 promoter, so as to construct four rebinant plasmids. 293FT cells id and tids, and the lentivirus titer ined according to the expression level of green fluorescent protEin (GFP). Mouse spleen lymphocytes RNA transcription and protEIn expression of these cells e RT-PCR and VΔ8.91及包膜蛋白质粒pMD.G为本实验室保存。限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ、T4 DNA 连接酶购自美国Neine 2000购自Invitrogen公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Promega公司。抗小鼠CD28单克隆抗体购自Santacruz Biotechnology，碱性磷酸酶标记山羊抗大鼠IgG购自北京中杉金桥公司。Purified anti-mouse CD3ε购自Biolegend公司。聚凝胺购自德国Fluka公司。鼠IL-2购自美国RD公司。小鼠CD28基因荧光定量PCR试剂盒购自广州达晖生物有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 双链DNA的设计及合成 根据Genebank公布的小鼠CD28基因的序列(NM 007642)，设计3对shRNA干扰序列及1对非特异性干扰序列(表1)。经BLAST同源性检索确认与CD28以外的小鼠已知基因序列无同源性。每条Oligo DNA由19 nt的寡核苷酸序列以正反向组合，中间添加Loop结构(TTCAAGAGA)，使寡核苷酸可以形成发夹结构，每对寡核苷酸两端分别带有HpaⅠ和XhoⅠ酶切位点，转录终止信号(TTTTTT)位于Oligo DNA 3′末端。以上Oligo DNA由Invitrogen公司合成。表1 插入慢病毒载体Oligo DNA的序列 　　1.2.2 慢病毒载体的构建及鉴定 设计并合成好的Oligo DNA退火形成双链DNA，与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后胶回收的pLB线性化片段连接，连接后的重组质粒命名为pLB-CD28/shRNA，包括特异性干扰质粒pLB-CD28/shRNA1、2、3和非特异性干扰质粒pLB-CD28/shRNA4。使用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增并予琼脂糖凝胶电泳鉴定。引物根据Primer Premier5.0软件设计，上游引物: 5′- AAA GGA AAC TCA CCC TAA CTG T -3′ ，下游引物: 5′- TGG AAT CTC GTG AAG CGA G -3′。预期片段大小为171 bp，挑选PCR鉴定与预期相符的重组阳性克隆菌液送Invitrogen公司进一步测序鉴定。 　　1.2.3 慢病毒载体的包装及滴度测定 将包装细胞293FT细胞接种于10 cm培养皿，采用Lipofectamine 2000将pLB-CD28/shRNA、pCMVΔ8.91、pMD.G三质粒进行共转染，转染后24、48 h用荧光显微镜观察转染效率。收集48、72 h病毒上清，4℃ 70 000 g离心2 h，分装后置-80℃保存。采用有限稀释法荧光显微镜下观察GFP表达并 计算 病毒滴度，公式为：病毒滴度=(GFP阳性细胞个数×稀释倍数)/ml。 　　1.2.4 慢病毒感染脾细胞并分选GFP阳性细胞 取C57BL/6小鼠脾脏单个核细胞，制成细胞密度为1.5×109/L的细胞悬液，在含10% FBS的RPMI 1640培养基(含rhIL-2 1×105U/L、anti-mouse CD3ε 5 mg/L)中培