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第四章 目的基因的分离 原核生物基因的组成 真核生物基因的组成 真核生物基因的组成 结构基因 结构基因（Structural gene）是指一类不仅可转录成信使RNA（mRNA），而且可翻译成多肽链，从而构成各种结构蛋白质（包括催化各种生化反应的酶）的基因。 第一节 目的基因的制备 直接分离法 构建基因组文库分离法 构建cDNA基因文库分离法 聚合酶链式反应技术扩增目的基因 基因的化学合成 一、直接分离法 限制性核酸内切酶酶切分离法 基因分离的物理化学法 “鸟枪法” 二、构建基因组文库分离法 1、基因组 DNA 文库（genomic DNA library） 从生物组织细胞提取出全部 DNA，用物理方法或酶法将 DNA 降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组 DNA片段与载体连接的重组 DNA 分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各 DNA 片段克隆的集合体。 2、基本步骤 ①细胞染色体大分子DNA提取和大片段的制备； ②载体 DNA 的制备； ③载体与外源大片段的连接； ④体外包装及基因组 DNA 文库的扩增； ⑤重组 DNA的筛选和鉴定。 3、基因组 DNA 文库的特点 1975 年，Clarke 和Carbon提出计算重组子数目的公式： N=ln（1-P）/ ln（1-f） 三、构建cDNA基因文库分离法 1、cDNA 基因文库概念 提取出组织细胞的全部 mRNA，在体外反转录成 cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段 cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部 mRNA信息的 cDNA克隆集合称为该组织细胞的 cDNA 文库。 2、构建步骤 细胞总 RNA 的制备及 mRNA 的分离与完整性的确定； cDNA 第一条链与双链 cDNA 的合成及克隆； cDNA 与载体的连接、噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化与鉴定等。 3、cDNA 克隆的主要优点 特别适用于某些RNA病毒的基因组结构研究 筛选比较简单易行 目的基因的选择中出现假阳性的概率比较低 可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆 可用于真核细胞 mRNA 的结构和功能研究 4、cDNA 克隆的主要缺点 cDNA 文库所包含的遗传信息要远远少于基因组 DNA 文库 不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外大量的调控序列的结构与功能方面的信息 低丰度 mRNA的 cDDNA 克隆所占的比例比较低 四、聚合酶链式反应技术扩增目的基因 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）技术简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。 第四节 目的基因 二、分离目的基因的途径 4、聚合酶链式反应技术扩增目的基因 PCR原理 ： 通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 2、PCR步骤 DNA变性（90℃-96℃） 退火（25℃-65℃） 延伸（70℃-75℃） 3、典型的PCR反应体系 五、基因的化学合成 人工合成基因的方法主要有两条途径： 生物合成 化学合成 1、全片段酶促连接法 2、酶促填充法 第二节 核酸的制备 天然DNA的制备 天然RNA的制备 核酸样品的分析与检测 染色体DNA 病毒和噬菌体DNA 质粒DNA 线粒体和叶绿体DNA 保持核酸分子一级结构的完整性 防止核酸的生物降解 生物材料的准备 裂解细胞 分离和抽提 * * 1、PCR的原理 天然DNA的种类 核酸分离、纯化原则 分离提取核酸的主要步骤