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第四课 DNA琼脂糖凝胶电泳 实验原理 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳 迁移率（又称泳动率）是带电荷颗粒在一定电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。迁移率与样品分子所带电荷密度、电压及电流成正比，与样品的分子大小、介质粘度及电阻成反比。 核酸是两性分子。DNA的等电点为4~4.5，RNA的等电点为2~2.5。当pH3.5时， DNA的碱基上的氨基解离，而三个磷酸集团只有第一个解离，整个核酸分子带正电荷。当pH在8.0以上时，碱基几乎不解离，磷酸集团全部解离，核酸分子带负电荷。不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，迁移率差别很小。 琼脂糖是从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰的聚合链线性分子。使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，具有分子筛效应。电泳时，分子大小和构象不同的核酸分子在琼脂糖中的迁移率有较大差异，可以被有效分离。 琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，是分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。 实验原理 琼脂糖凝胶浓度和有效分离线性DNA分子的长度之间的关系 实验原理 溴化乙锭（Ethidium bromide，EB）是一种高度灵敏的荧光染色剂，溴化乙锭用302nm和366nm紫外光激发并放射出590nm橙红色信号。 观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用溴化乙锭进行染色。溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的激发光。 溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的NDA条带。 溴化乙锭嵌入DNA碱基对之间是，可使DNA的负超螺旋解旋，因此可降低负超螺旋DNA的电泳迁移率。如电泳目的是比较不同大小的DNA的分子量，应在电泳完毕后用0.5ug/ml的溴化乙锭染色半小时。 溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。因此溴化乙锭是强诱变剂，具有高致癌性！ 溴化乙锭溶液的须净化处理后方可丢弃。 实验器材及试剂 实验器材 电泳仪 电泳槽 琼脂糖凝胶制胶板 梳齿 实验试剂 琼脂糖 100bp，1kb梯度DNA分子量标准 50XTAE电泳缓冲液体（ 1×缓冲液浓度40 mM TrisHAc, pH 8.0, 1 mM EDTA ） 6X样品缓冲液 GoldView核酸指示剂(或溴化乙锭) DNA样品 实验步骤 在锥形瓶中用1XTAE配制1%的琼脂糖凝胶（40ml）。 置微波炉中加热至沸腾,使琼脂糖完全溶解。 将锥形瓶取出，摇晃混匀，再将琼脂糖置微波炉中加热至沸腾。 置室温冷却。 准备制胶板，插好梳齿。 当琼脂糖冷至70℃左右（手握烧瓶可以耐受），加2ulDNA染料（GoldView），混匀。 将凝胶到入制胶板（注意，不要产生气泡）。在室温静置30分钟。 待凝胶完全凝固后，小心拔去梳齿。 将凝胶放入电泳槽中。在电泳槽中加入1XTAE至液面漫过凝胶表面约1-2mm。 吸取5?l质粒（或PCR产物）DNA+ 1?l 6X电泳样品缓冲液混匀。 将样品小心加入电泳凝胶的样品孔中。 在样品旁边的孔中加入6?l DNA分子量标准品。质粒用1kbDNAmarker，PCR产物用100bpDNAmarker。 正确连接电泳仪器电极，以8V/cm的恒定电压电泳25-30分钟。 电泳结束后，关闭电泳仪。将凝胶取出。 置紫外灯箱上在适当波长的紫外灯下观察质粒DNA的电泳情况。 注意事项 一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳齿，应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃ 冰箱中冷却15 min 左右。 加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。 正确连接电泳仪的电极。 电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同。 电泳缓冲液刚好没过凝胶1-2 mm 为好，电泳缓冲液太多则电流加大，凝胶发热。 电泳时凝胶上所加电压一般不超过10v／cm(指的是正负电极之间的距离，而不是凝胶的长度)。若电压过高分辨率会降低。 电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，一般用2～3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。 使用溴化乙锭对DNA样品进行染色，可以在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB。EB掺入DNA分子中。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，但是如果要测定核酸分子大小时，不宜使用以上方法，而是应该在电泳结束后，把凝胶浸