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人脂肪组织基质血管组分的分离培养.doc
人脂肪组织基质血管组分的分离培养
作者:庄伟, 谢良地, 黄杰, 许昌声
【关键词】 脂肪组织; 细胞外基质; 细胞,培养的
ABSTRACT: Objective To establish a method for the isolation and culture of stromal vascular fraction(SVF) of human adipose tissue in vitro, cells. Methods Normal human abdominal subcutaneous adipose tissue munofluorescence assay ine the presence of the surface molecule marker CD31 and CD34. Results Immunofluorescence assay shoethod cells from human adipose tissue, plication of stem cells.
KEY EMF12培养基(含HEPES,美国Gibico公司),胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS,杭州四季青生物技术有限公司),牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA,美国Amresco公司),CD31、CD34山羊源性单克隆抗体、猴抗山羊FITC二抗(美国Santa Cruz公司),L多聚赖氨酸、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶(美国Sigma公司),25 cm培养瓶(美国Constar公司)。
1.2 方法
1.2.1 脂肪组织取材 在手术室无菌条件下,取正常体质量的腹部手术患者的腹部皮下脂肪,置于PBS缓冲液中。
1.2.2 脂肪组织消化 剪取脂肪组织约500 mg,剔除肉眼可见的血管及纤维部分,PBS冲洗3次,剪切成约1 mm×1 mm×1 mm的组织块,移入酶消化液4 mL中,内含1%BSA和0.1%Ⅰ型胶原酶,37 ℃消化60 min,消化期间每间隔5 min上下振荡1次。加入含15%胎牛血清的DMEMF12培养基终止消化。
1.2.3 SVF处理
1.2.3.1 分离 80目(75 μm)网筛过滤组织消化液,去除未消化残余组织。将滤液移入新的10 mL离心管, 1 800 r/min离心10 min,可见离心管内液体分为4层。先吸除表层的脂滴和次层乳状的成熟脂肪细胞,再吸弃第3层上清液体,留下底层沉淀物SVF。加入含15%胎牛血清的DMEMF12培养基1 mL吹打重悬,计数。
1.2.3.2 接种培养 在25 cm培养瓶中预先置入含15%胎牛血清的DMEMF12培养基3 mL,覆盖培养瓶底面,将重悬的SVF细胞悬液移入培养瓶,细胞密度为20 000 cm-2。培养瓶置37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱培养。6 h后换液,去除未贴壁细胞。此后每3天更换1次培养基。
1.2.3.3 传代 约1周后,细胞融合达到70%~80%时,可以传代。吸弃上清培养液,用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液浸润1遍,吸弃,倒置相差显微镜下观察见细胞回缩,间隙增大,吸弃消化液即加入含15%胎牛血清的DMEMF12培养基终止消化,吸管轻柔吹打脱壁。移入10 mL离心管, 1 800 r/min离心5 min,弃上清,加入含15%胎牛血清的DMEMF12培养基1 mL重悬。第2代细胞用于免疫荧光组织化学染色鉴定。
1.2.3.4 鉴定 采用免疫荧光组织化学染色鉴定。SVF细胞接种于24孔板内L多聚赖氨酸预包被的盖玻片上,用于免疫荧光组织化学染色鉴定。室温下,37 ℃预热的PBS洗去培养基,4%多聚甲醛固定30 min,PBS漂洗5 min×3次。加入0.1%TritonX溶液,室温作用30 min,PBS洗涤5 min。正常4%BSA于37 ℃封闭20 min。分别加入CD31、CD34山羊源性单克隆抗体(CD31检测内皮细胞,CD34检测干细胞),置4 ℃冰箱孵育过夜。PBS冲洗5 min×3次,加入猴抗山羊FITC二抗,37 ℃作用45 min,PBS液漂洗5 min×3次。荧光显微镜下拍照观察。以PBS取代一抗为阴性对照。
1.3 结果 (1)细胞形态学。接种后细胞在6 h内大部分贴壁,24~48 h贴壁牢固。相差显微镜下,最初为小圆形,细胞大小不等,核浆比较大。2~4 d后可见细胞伸展,核呈椭圆形,较大,之间混有少数形态、体积不一的细胞。绝大部分细胞的生长呈现明显的聚集性(图1)。原代细胞约1周左右可以达到70%~80%融合。常规传代后,第2代以后的细胞约4 d左右即可以达到70%~80%融合。(2)免疫细胞学。第2代脂肪SV
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