双亚型(H5-H7)流感病毒血凝素基因真核表达质粒的构建及其在BHK细胞中的表达.docVIP

　　双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素基因真核表达质粒的构建及其在BHK细胞中的表达 作者：白靓 金宁一 成岩 石毅 王芳 鲁会军 南文龙 关铭 【摘要】 目的 构建双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素真核表达载体，并在幼仓鼠(BHK)细胞中进行表达。方法 通过PCR方法分别改造流感病毒H5亚型血凝素(HA)和H7亚型HA基因片段，在融合片段间引入具有柔性功能的(G4S)3 linker和具有自裂解功能的口蹄疫蛋白2A linker。将融合后的基因片段H5HAH7HA克隆至真核表达载体pVAX1。选用BHK真核表达细胞系，用脂质体转染法将纯化后的表达质粒在细胞进行表达，转染后48 h，用间接免疫荧光法(IFA)检测目的基因的表达情况。结果 表达双亚型(H5/H7)流感病毒血凝素基因的重组真核表达质粒pVAX1H5HAH7HA 经酶切和测序证明构建正确。转染重组质粒的BHK细胞可检测到目的蛋白的表达。结论 成功构建了真核表达质粒pVAX1H5HAH7HA，并在BHK真核细胞中正确表达，为H5、H7双亚型核酸疫苗的研究奠定了基础。 【关键词】 流感病毒;血凝素;真核表达;BHK细胞 H5N1及H7N7亚型禽流感都给人类造成了巨大的损失，甚至跨种传给人类，造成流感的流行〔1，2〕。老年人与儿童由于免疫力相对较低，成为潜在高危易感人群。血凝素(HA)是介导病毒与细胞表面结合的主要成分,是流感疫苗研究的重要抗原标靶，有研究证明HA作为DNA疫苗免疫实验动物可获得良好的免疫保护〔3〕。本文旨在构建流感双价(H5HA/H7HA)DNA疫苗，并在幼仓鼠肾(BHK)细胞中表达，为进一步开发基因工程疫苗奠定基础。 　 　1 材料与方法 　　1.1 材料 BHK细胞株、大肠杆菌DH5α、真核表达载体pVAX1、含有H5HA全阅读框架质粒、含有H7HA全阅读框架质粒，由 中国 人民解放军基因工程实验室保存;工具酶、DNA分子量Marker、质粒提取试剂盒、克隆载体pMD18T购自Takara公司。DNA回收试剂盒购自QIAGEN公司;脂质体Lipofectatime 2000购自Invitrogen公司;山羊抗兔IgG荧光抗体购自中杉金桥生物技术有限公司;兔抗流感病毒H5亚型HA抗体和H7亚型HA抗体购自昆山杰恩生物技术有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 H5HA和H7HA基因的引物设计 根据GenBank中报道的流感病毒H5HA(AY653200)和H7HA(AJ704813)cDNA序列，设计并合成2对特异引物，引物序列如下：H5HA上游引物A1:5′GCTAGCCCCGGGGCCGCCACCATGGAGAAAATAGTG 　　CTTCTTCT3′(含NheⅠ酶切位点);下游引物A2：5′CTCGAGGACTCATTAATCGATAAGCTTAGACCCTCCGCCTCCGGAG 　　CCTCCTCCTCCGGAGCCTCCGCCTCCAATGCAAATTCTGCATTG 　　TAAC3′〔含XhoⅠ和ClaⅠ酶切位点及(G4S)3柔性linker〕。H7HA上游引物B1：5′ATCGATAACTTTGACCTGCTCAAGTTGGCAGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCTTTCTTCTTCATGA 　　ACACTCAAATCCTGGT3′(含ClaⅠ酶切位点及口蹄疫病毒2A蛋白linker);下游引物B2：5′CTCGAGTCAATTGCCGATTGGGTGCTTTTGT3′(含XhoⅠ酶切位点)。 　　1.2.2 H5HA和H7HA基因PCR扩增 分别以含有H5HA和H7HA全阅读框架质粒为模版，A1、A2和B1、B2为引物，PCR扩增H5HA和H7HA基因。 PCR反应条件为：94℃变性5 min;94℃变性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸90 s，30个循环;72℃再延伸10 min。产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。 　　1.2.3 重组克隆质粒的构建 回收PCR产物，连接到pMD18T载体上转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，大量扩增，并用质粒快速提取试剂盒提取质粒用于核酸测序及酶切鉴定。含目的基因的重组质粒命名为pMD18TH5HA和pMD18TH7HA。 　　1.2.4 重组真核表达质粒的构建 使用NheⅠ和XhoⅠ分别双酶切鉴定正确的质粒pMD18TH5HA和pVAX1，回收H5HA片段和载体片段，以T4DNA连接酶连接后，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，大量扩增，提取质粒，酶切鉴定，阳性质粒命名为pVAX1H5HA。使用ClaⅠ和XhoⅠ分别双酶切鉴定正确的质粒pMD18TH7HA和pVAX1H5HA,回收H