免疫药实验方法-药理实验方法学-研究生.ppt

* anthrax diphtheria tetanus * Cholera 霍乱 Tubercule bacillus结核杆菌 * * One cell type in a mixture is labeled with a specific monoclonal antibody coupled to a very small magnetic bead. The cells are passed over a column which is placed in the magnetic field of a MACS separator. The magnetically labeled cells are retained in the column, the unlabeld cells run through. Then, the column is removed from the magnet and the labeled cells are eluted as the positive fraction. We call this a positive selection. * 2 分光光度法 【基本原理】 又称SRBC的定量溶血测定法，基本原理同溶血空斑法。但本法可定量测定抗体形成细胞所分泌的抗体，较溶血空斑法精确。同时操作比较简便。 * 【操作步骤】 （1）免疫动物：同前。 （2）制备脾细胞悬液：基本同前，制成5×106/ml脾细胞悬液，或按15mg脾重/ml制成脾细胞悬液。 （3）溶血反应：取试管若干只，每管依次加入脾细胞悬液、0.2％SRBC、1∶10豚鼠血清各0.5ml，充分混匀，另设不加补体的空白组。置37℃水浴中温育1h，离心3000rpm，5min。 （4）测OD值：取上清测OD413nm。 * 【注意事项】 （1）若使用杂种鼠时，宜将每两只小鼠的脾混合液制备脾细胞悬液，可减少实验误差。 （2）反应系统中其他条件不变时，SRBC浓度可根据受试药的免疫增强or抑制作用作适当调整。 * 三、影响特异性细胞免疫功能的实验方法 （一）淋巴细胞转化试验（3H-TdR掺入法） 【基本原理】 淋巴细胞在有丝分裂原的刺激下，转化为母细胞，并分化增殖，细胞内蛋白质和核酸合成增加，并释放多种淋巴因子。如在培养液中加入3H-TdR，使其掺入到新合成的DNA中，可以定量细胞内的DNA合成强度。 * 有丝分裂原： PHA（植物血凝素） ――刺激T细胞 Con-A（刀豆球蛋白） ――刺激T细胞 LPS（脂多糖） ――刺激B细胞 * 【操作步骤】 （1）纯系小鼠，2～3月龄，雌雄均可。处死小鼠，在无菌条件下迅速取出脾脏，放入盛有RPMI1640培养液的平皿中（冰浴），剪碎，用注射器针芯捣烂，过100目钢筛，制成脾细胞悬液。 （2）用培养液离心洗涤脾细胞3次，用台盼蓝检查活细胞数在95％以上。将细胞用培养液稀释成2×106个/ml。 * （3）将脾细胞加入96孔培养板，每孔200μl，3～4复孔（也可更多）。加入有丝分裂原，培养72h。 （4）终止前6h，每孔加入3H-TdR 1ml，使其终浓度为1～5μci/ml。 （5）用微量多头细胞收集仪，将细胞抽吸在49型玻璃纤维滤纸上，置80℃烘箱内干燥30min。 （6）将烘干的滤纸片放入盛有闪烁液的小瓶中，用液闪仪测定样品中的放射强度（cpm）。 * 【注意事项】 （1）无菌操作。 （2）脾细胞制备要放在冰浴中，避免细胞死亡带来误差。 （3）中药粗制剂中影响因素较多，注意假阳性。 【评价】 （1）3H-TdR掺入法客观准确。经典方法。 （2）可直接观察药物本身对淋巴细胞转化的影响，也可观察与有丝分裂原的协同or拮抗作用。 * MTT法： 【基本原理】 Mosmann等根据细胞内能量代谢水平与DNA合成水平平行相关，首创了四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法。MTT进入细胞后作为反应底物，被氧化成蓝色的甲臜（formazan），存积于细胞内及周围，加入DMSO，使细胞破裂，并使细胞内甲臜释放出来，测定OD490nm。 * （二）二硝基氟苯诱导小鼠DTH反应 【基本原理】 DNFB是一种半抗原，将其溶液涂抹腹部皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4~7天后将其再次涂抹皮肤，可使局部产生DTH反应，一般在抗原攻击24~48h达高峰，故此时测定局部肿胀。 * 【操作步骤】 （1）致敏：小鼠，随机分组，腹部去毛，范围约3×3cm2，并将1％DNFB溶液均匀涂抹于腹部皮肤，必要时于次日再强化一次。