内皮抑素基因对鼠移植性肝癌抑制作用的实验性研究.docVIP

　　内皮抑素基因对鼠移植性肝癌抑制作用的实验性研究 作者：王建立　李朝阳　孙学英　藏运金　沈中阳 【摘要】 　　目的：探讨血管内皮抑素endostatin对体内人肝癌细胞在体内的 影响 。 方法 ：将以pcDNA3.1为载体的鼠源性 endostatin基因转染人肝癌细胞SMMC7721建立的裸鼠的肝癌模型。 应用 免疫组化和VD）和血管内皮生长因子（VEGF）的阳性率。同时观察转基因肿瘤的生长情况。结果：可见endostatin在肝癌细胞的稳定表达和分泌，其MVD显著低于对照组（Plt;0.05）,VEGF同对照组比较差异亦有显著性（P lt;0.05）。 结论：endostatin基因对人肝癌细胞SMMC7721在裸鼠体内的生长有显著的抑制作用，endostatin能减慢肿瘤生长速度，但不能完全消除肿瘤。 【关键词】 基因，endostatin　肝癌　体内转染 　　Study on endostatin inhibitation of the groice 【ABSTRACT】 Objective: To explore the effect of endostatin on the groan liver carcinoma in vivo. Methods: Mice endostatin gene ice. Immunohistochemistry and VD), the positive rate of vascular endothelial gromunohistochemical methods. The gromunohistochemistry and MC7721 cells, pared ediated by pcDNA3.1 might inhibit the groan hepatic cancer SMMC7721 in vivo. 【KEY MC7721建立裸鼠肝癌的皮下转移瘤模型，研究血管内皮抑素（endostatin）对肝癌生长的抑制作用，并探讨其对肝癌细胞凋亡的影响。 1　材料和方法 １．１　材料　4～5周龄裸小鼠（购自 中国 科学 院上海实验动物中心），雌雄各半，在特异性无致病原菌条件下（specific pathogen free condition，SPE）饲养。人原发性肝癌细胞系SMMC7721购于中国科学院上海细胞生物学研究所。用含有10%小牛血清的RPMI 1640（购于GIBCO公司）在37℃、5%CO2条件下培养。pcDNA3.1，endostatin /pcDNA3.1由孙学英博士惠赠。限制性内切酶BamHⅠ，HindⅢ购自生物工程（大连）有限公司。质粒DNA小量纯化试剂盒（MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 2.0，50次量），购自生物工程（大连）有限公司。其他试剂包括：endostatin的抗体(Calbiochem-Novabiochem, La Jolla，CA)、兔多克隆VEGF抗体（Lab Vision Corporation, CA, USA）、抗CD31抗体（Pharmingen，CA，USA）和二抗（VECTASTAIN UniversaL Quick Kit，Vector Laboratories，Burlingame, CA，USA）。 1.2　方法 1.2.1　细胞传代培养及分组　用RPMI 1640细胞培养液，25 cm2/50 ml细胞培养瓶传代培养3～4代后，再用75 cm2/200 ml细胞培养瓶扩传培养，待细胞生长至对数生长期，用0.25%胰蛋白酶消化，用PBS制成细胞悬液，调整细胞密度至3×107 ml-1，用于建立动物模型。荷瘤裸鼠随机分为2组，分别为pcDNA3.1组（对照组）和endostatin/pcDNA3.1组（治疗组），每组12只。其中6只观察生长曲线，另6只切取肿瘤标本供实验室检查用。 1.2.2　转染裸鼠　制备DH5α感受态大肠埃希菌:重组质粒（即携带目的基因的质粒，含青霉素抗性遗传标志）转化感受态的DH5α大肠埃希菌。碱裂解法制备少量质粒DNA、酶切、电泳并测序，证实含目的基因。碱裂解法制备大量质粒DNA：5%葡萄糖、0.01%TritonX-100将质粒稀释成1 mg/ml，然后与脂质体按1：3体积比混合，转染裸鼠。 1.2.3　检测指标和检测方法 　　（1）观察endostatin对肿瘤的抑制作用。转染基因后，每天观察肿瘤生长状态，第0、 3、 6、 9、 12和 15天测量肿瘤长短径， 以观测目的基因对肿瘤的抑制作用。 　　（2）免疫组织化学检测。基因转染肿瘤2 d后杀死小鼠制作切片（10 μm），用兔多克隆抗鼠endostatin抗体，VE