基因组学二(赵利峰 201.pptVIP

* * 3.2 基于克隆的基因组作图 克隆载体： 质粒、噬菌体、粘粒…… 啤酒酵母基因组 主要是先构建粘粒文库，然后建立克隆重叠群完成测序。 高等生物基因组 拟南芥1.2X105bp，需要25000个克隆。 人类基因组是拟南芥基因组的33倍。 * 酵母人工染色体YAC：重组YAC分子只能在酵母细胞中扩增。YAC载体由三部分构成： 着丝粒：在细胞分裂时负责染色体均等分配。 端粒：位于染色体端部的特异序列，保持人工染色体的稳定性。 自主复制起始点：在细胞中启动染色体的复制。 缺陷：插入子稳定性问题、同一酵母细胞多个YAC引起交换产生嵌合。 3.2.1 大分子DNA的克隆载体 * 酵母人工染色体（YAC）操作 * 噬菌体P1载体：与λ载体相似，将天然噬菌体基因组中的一段区域缺失，容量达125kb。 细菌人工染色体BAC：由大肠杆菌中F质粒衍生，容量达300kb，单拷贝复制，稳定，不会因重组发生嵌合。 P1人工染色体PAC：结合P1载体和BAC载体的优点。 * BAC 载体物理图 * PAC 载体物理图 * 载体的种类和特征 质粒* 受体细胞 结构 插入片断 举例 E.coli 环状 〈 8* pUC18/19 , T-载体pGEM- 3z等 λ噬菌体 E.coli 线状 9 - 24kb EMBL系列， Λ gt系列 丝状噬菌体及噬菌粒 E.coli 环状 〈 10 kb M13mp系列 粘粒载体 E.coli 环状 35- 45kb pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome) E.coli 环状 ≈300 kb Pel oBAC系列 PAC (P1-derived Artificial chromosome) E.coli 环状 100 - 2000 kb PCYPAC1 YAC (Yeast Artificial chromosome ) 酵母细胞 线性染色体 100 - 2000 kb MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 哺乳类细胞 线性染色体 〉 1000 kb 病毒载体 动物细胞 环状 SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 穿梭载体 动物细胞 和细菌 环状 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒 * 3.2.2 重叠群组建 重叠群contig：相互间存在重叠顺序的一组克隆。 最早组建重叠群方法—染色体步移：从基因组文库中挑取一个指定的或随机的克隆，然后在文库中寻找与之重叠的第二个克隆。在此基础上再寻找第三个克隆，依次延伸。 染色体步移的速度缓慢，仅适合于小基因组及小区段染色体的物理图绘制。 * 染色体步移 * 指纹作图 指纹fingerprinting：DNA样品所具有的特定DNA片段组成，限定的序列特征。指纹重叠，表明2个克隆具有共同的区段。 限制性带型指纹：用不同限制性酶处理样品，凝胶分析，DNA条带有部分相同，说明它们含有重叠的序列。 重复序列DNA指纹：不同克隆酶解电泳，转移到杂交膜中，用一种或几种基因组范围的重复序列作为探针杂交，出现相同的杂交带型，说明克隆重叠。 重复序列DNA PCR：设计与重复序列互补的引物，对检测的克隆进行PCR扩增，相同的产物，说明克隆重叠。 STS作图指纹：STS是已知的单一序列。设计引物，对大量的单个克隆进行PCR扩增。 * 3种克隆指纹分析方法 * 3.3 染色体细胞图 荧光标记原位杂交（FISH）：与同位素杂交的原理相同，DNA荧光染料。荧光标记信号在显微镜下观测，直接显示探针与染色体杂交的位置。 杂交技术的一种延伸，杂交靶子是完整的染色体，由杂交信号提供作图信息。将样品涂抹在载玻片上自然干燥，然后用甲酰胺处理使其变性。 中期染色体：主要用于确定新发现的分子标记属于哪条染色体，给出十分粗略的染色体定位。 机械伸展的染色体：分离与制备中期细胞核，离心，获得伸展的染色体，长度增加20倍。 间期染色体：已获得基本的位置信息，极度松驰的染色体可用于小区段分子标记排序研究。 * 3.4 辐射杂种作图 主流技术的缺点 限制性作图：快速，信息详细，但不适合大基因组。 重叠群构建程序复杂，费时费力。 指纹作图：对大基因组存在不少问题，如选用的限制酶不当或重复顺序干扰，会出现误排。 原位杂交：操作困难，资料积累慢，一次实验定位的分子标记不超过3-4 个。 * STS：sequence tagged site，一小段长度100-500bp的DNA序列，每个基因组仅一份拷贝，易分辨。 利用PCR/杂交分析STS位置，自动操作。 表达序列标签EST：cDNA。 SSLP：具有多态性并已在连锁分析中定位。 随机基因组序列：在数据库中寻找所感兴趣的某