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三、实验用品及试剂 恒温水浴锅、微量加样器、枪头、凝胶电泳系统、凝胶成像系统 酶Hind III 和 BamH I 核酸内切酶（Takara）， Hind III和 BamH I酶解缓冲液(10×通用 buffer)，琼脂糖，pMD18-T质粒，加样缓冲液 生物化学资料网 * 四、实验步骤 对初步确定有外源基因进入的质粒用限制性内切酶进行切割，进行进一步的鉴定 重组质粒DNA 10ul ddH2O 7ul 10×通用缓冲液 2ul BamH I（10U/ul） 0.5ul Hind III（10U/ul） 0.5ul 总体积 20ul 2. 37℃ 保温0.5-1h 3.利用空载体与目的基因片段为对照，对酶切后的片段进行比对，从酶切后的片段的数目及大小上进行确认 * 五、思考题 除了酶切鉴定重组质粒外，还可以选用何种方法鉴定？ * １、在0.2ml PCR 微量离心管中配制30ul反应体系。 　　　 　dd water 　　　　　　　　20.5ul 10×PCR buffer（不含MgCl2） 　　　　　　　3ul 25mM MgCl2 　　　　　　　2ul 10mmol/L dNTP 　　　　 　　　　　1ul 10μmol/L Primer 1 　　　　　　　　1ul 10μmol/L primer 2 　　　　　　　　1ul 模板 　　　　　　　　　　　　　1ul 　Taq酶 　　　　　　　　　　　　　0.5ul 总体积 　　　　　　　　　　　30ul 四、实验步骤 * ２、在离心机中混匀。 ３、ＥＰ管放入ＰＣＲ仪中，按照原理中的条件设置程序，进行ＰＣＲ反应。 ４、PCR结束后，取3ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。 * 五、思考题 PCR中产生非特异性条带的原因可能有哪些？ * 实验四 凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接 * 一、实验目的 1. 学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法。 2. 掌握DNA体外连接的方法。 * 二、实验原理 DNA分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关 DNA分子大小 DNA分子构象 琼脂糖凝胶浓度 电泳所用电压 电泳缓冲液 生物化学资料网 * 2. 利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA，而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。 3. Taq酶参与PCR反应中，产物双链核酸中的3’端各多连接一个脱氧腺苷酸A，与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒。 生物化学资料网 * 三、实验用具及试剂 凝胶电泳系统，刀片，紫外仪，酒精灯 1.5ml EP管，1.5ml EP管架，65℃ 水浴锅 PCR产物，1×TBE，加样缓冲液，TakaRa胶回收试剂盒，TA克隆试剂盒，DL2000 marker 生物化学资料网 * 1. 2%琼脂糖凝胶电泳 2. 在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA琼脂糖块装在1.5ml的EP管中称量减1克即为凝胶块重量 3. 加入5个凝胶体积量的DR-Ⅰ Buffer 4. 混匀 65℃加热融化凝胶块 5. 加入DR-ⅠBuffer量的1/2 体积的DR-Ⅱ Buffer, 当目的片段小于400bp再加入终浓度为20% 的异丙醇 6. 将上述溶液short后转移至spin coloumn中12000rpm, 1min 弃滤液 7. 加入500ul RinseA 12000rpm 30s 弃滤液 8. 加入700ul RinseB 12000rpm 30s弃滤液 9. 同8 四、实验步骤 * 10. 将spin coloumn安置于新的1.5ml EP管中 在spin coloumn膜中央加25ulElution Buffer 放入烘箱1min 12000rpm 1min 保存1.5ml EP管1%胶检测 11. 链接反应（冰上操作） 在一支0.2 ml EP管中加入以下试剂： 纯化的目的DNA片段 4.5ul Vector