感受态细胞的制备及重组质粒.pptVIP

experiments of molecular biology 感受态细胞的制备及重组质粒的转化 experiments of molecular biology * 重组DNA技术 分：分离外源基因目的基因。 切、接：利用酶学方法，将外源基因与载体连接，形成复制子。 转：转化宿主细胞，使复制子可以扩增复制。 筛：筛选含有目的基因的细胞(转化子)并扩增以获得目的基因克隆。 * 重组DNA技术的基本工具 “分子手术刀” 限制性核 酸内切酶 “分子 运输车” “分子 缝合针” DNA 连接酶 “分子 运输车” 基因进入 受体细胞 的载体 * 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能允许含有外源DNA的载体分子通过的细胞，即感受态细胞(competent cell) 。 感受态细胞(competent cell) * 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。 转化是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。 转化（transformation） * 化学的方法(CaCl2法、热休克法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热休克处理将载体DNA分子导入受体细胞。 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 转化的方法 * 转化原理（CaCl2法） 将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域； 此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上； 经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。 * 转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体。 CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积 15-30％的无菌甘油于-70℃保存(半年)。 * 影响转化效率的因素 影响 因素 细胞生长状态和密度 杂菌和其它外源 DNA 的污染 载体DNA及重组DNA 受体细胞 试剂的纯度和 器皿的洁净度 转化操作 * 实验原理 本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，并用CaCl2处理使其处于感受态，然后与pMD19-T-X重组质粒共保温，实现转化。由于重组质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。 如受体细胞没有转入pMD19-T-X重组质粒，则在含Amp的培养基上不能生长。 能在含Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）已导入了重组质粒。 * 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基 * 实验仪器、材料 1 ．超净工作台 2 ．高速离心机 3 ．恒温摇床 4 ．恒温培养箱 5 ．恒温水浴锅 6 ．制冰机 7 ．移液枪 * 实验材料、试剂 1．大肠杆菌JM109菌株 2．重组质粒 3．1.5mL 离心管，Tip头 4．试管、培养皿 1． LB液体培养基 2．含有Amp的LB平板培养基（终浓度为50μg／mL） 3．氨苄青霉素贮存液（浓度50mg／mL） 4．0.1mol/L CaCl2溶液 * 实 验 安 排 1 受体菌的培养 感受态细胞的制备 2 3 质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化 实验 安排 * 一、受体菌的培养 从新活化的E.coli JM109平板上挑取一单菌落，接种于3ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。（已做） 将该菌悬液以1:50转接于50ml LB液体培养基中，37℃ 250rpm振荡扩大培养约1-2h，当OD600nm值为0.3～0.5时，取出置冰浴。 * 1、取1mL菌液于1只1.5mL离心管中，置冰浴5min，10000rpm离心 1min （每班需做对照管至少1管）（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳） ； 2、弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸上，每管加入0.5mL冰预冷 的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌，置冰浴10min； 3、4000rpm离心10min，弃上清； 4、每管加入50μL冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌，冰上放置， 即为感受态细胞。 二、感受态细胞的制备 * 1、实验管加5μL重组质粒DNA，对照管加5μL灭菌水，轻轻 混匀，置冰浴20min； 2、42℃水浴热应激90