第四章分子生物学研究法修定版13年.pptVIP

第四章 分子生物学研究法 本章内容 掌握： 细菌转化；DNA序列测定；基因敲除；RNA干扰；酵母双杂交；cDNA文库 了解： 其他相关分子技术 1DNA相关技术1.1细菌转化 定义：一个细菌细胞摄入并表达外源DNA的过程 (书上：指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的？DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程) （1）CaCl2法 转化过程中的受体细菌应是限制修饰系统缺陷型菌株并且0℃低渗CaCl2处理成感受态。 通过短暂的热刺激（42℃）可以使细菌摄 入外源DNA （2）电击法（电脉冲导致细胞膜凹陷随着跨膜电压的增加造成疏水性孔洞变为亲水性孔洞） *外源基因在细菌中的表达 目的基因体外扩增（PCR若是真核需从CDNA文库扩增或cDNA为模板扩增）（见问题） 与载体连接（酶切）（双酶切，单酶切） （表达载体/克隆载体、多克隆位点-包含多个(最多20个)限制性酶切位点(restriction site)的一段很短的DNA序列。也称为多位点接头(polylinker),是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列 ） 转化 筛选（质粒抗性标记，蓝白斑*，（菌落PCR） 诱导表达 　蓝白斑筛选的原理 :载体含lacZ的调控序列和N端。宿主细胞可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的。（lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补