小鼠窦前卵泡的玻璃化冷冻方法研究.docVIP

　　小鼠窦前卵泡的玻璃化冷冻方法研究 作者：常娟娟， 江一平， 王明权 【摘要】 目的 对性成熟前小鼠的窦前卵泡采用不同的方法进行玻璃化冷冻，探讨不同冷冻方法对卵泡复苏率的影响。 方法 用Ⅰ型胶原酶和脱氧核糖核酸酶Ⅰ分离10～14 d ICR雌鼠的卵巢，共进行A、B两个实验，每次实验对获得的卵泡分为4组，1组作为新鲜对照组，其余3组采用不同的冷冻方法处理,试验A采用常规玻璃化法、－205 ℃玻璃化法和液氮网篮法；试验B采用－205 ℃玻璃化法、液氮网篮法和－205 ℃表面玻璃化法，卵泡复苏后进行台盼蓝染色， 计算 各组卵泡复苏率。 结果 液氮网篮和－205 ℃玻璃化冷冻的冷冻效果一致，两种方法的卵泡复苏率差别无统计学意义；常规玻璃化的冷冻效果最差，－205 ℃表面玻璃化冷冻的冷冻效果最好，其冷冻小鼠窦前卵泡的复苏率达(83.02±4.10)%。 结论 －205 ℃表面玻璃化是一种较好的冷冻窦前卵泡的方法。 【关键词】 卵泡；卵子；冷冻；组织保存；小鼠，近交ICR ABSTRACT: Objective To investigate the influence of different methods on the recovery rate of preantral follicle of immature mice after they ale mice(10～14 d of age).Tents (A and B) ethods.In Experiment A,conventional vitrification,－205 ℃ vitrification and metal ent B, －205 ℃ vitrification,metal and －205 ℃ surface vitrification adopted.After recovery, follicles ents，the effect of metal and －205 ℃ vitrification are consistent.There .The effect of conventional vitrification ;freezing;tissue preservation;mice,inbred ICR 卵巢组织、细胞的冷冻保存技术是生殖工程的重要内容之一，可为体外授精、显微授精和体细胞核移植等需要储备和供应卵源的实验提供技术保障[1]。在既往的研究中，冷冻复苏的卵母细胞和卵巢组织都有部分能够发育到囊胚或者生育幼仔[26]，说明冷冻复苏后的卵母细胞及或各级卵泡保持了正常的发育潜能。但采用常规程序冷冻法和常规玻璃化冷冻法保存的卵巢组织、细胞，复苏率不高且方法繁琐[4]。本研究采用从小鼠卵巢分离的窦前卵泡为材料，探索建立适宜的窦前卵泡快速玻璃化冷冻保存技术，为卵泡保存和生殖工程提供技术基础。 　 　1 材料与方法 　　1.1 动物来源 　　出生10～14 d的 ICR雌鼠[上海斯莱克实验动物有限责任公司，SCXK（沪）2003003]。 　　1.2 仪器及试剂 　　Vitmaster玻璃化快速冷冻仪（URVD 000036，英国IMT Ltd）；ɑMEM(32571，美国Gibco公司)；牛血清白蛋白（BSA，A3311，美国Sigma公司）；Ⅰ型胶原酶（collagenaseⅠ，265，美国Gibco公司）；1 mg/mL脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ，10104159001，瑞士Roche公司）；HEPES（H6147，美国Sigma公司）；乙二醇（EG，E9129，美国Sigma公司）；海藻糖[D（＋）Trehalose dihydrate，T0167，美国Sigma公司]；聚乙烯吡咯烷酮（PVP，0507，美国Amresco公司）；台盼蓝干粉（Trypan，T6146，美国Sigma公司）；含卵泡分离液的双腔培养皿（353037，美国Falcon公司）；清洗皿：含体外操作液的35 mm培养平皿（353001，美国Falcon公司）。 　　1.3 方法 　　1.3.1 溶液配制 　　基础液：采用添加4 mg/mL牛血清白蛋白的αMEM作为卵泡分离液、体外操作液、玻璃化冷冻液和复苏液的基础液；卵泡分离液：于基础液中添加3 mg/mL Ⅰ型胶原酶、1 mg/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ；体外操作液：于基础液中添加25 mmol/L HEPES；平衡液（equilibration medium，EM）[7]：于基础液中添加4%乙二醇；玻璃化冷冻液（solid surface vitrification，SSV）[7]：于基础液中添加35%乙二醇0.4 mol/L海藻糖、5%聚乙烯吡咯烷酮；复苏液：包括Ⅰ、Ⅱ，分