异硫氰酸苯己酯调控组蛋白乙酰化并诱导Molt4细胞凋亡的研究.docVIP

　　异硫氰酸苯己酯调控组蛋白乙酰化并诱导Molt4细胞凋亡的研究 作者：马旭东， 黄轶群， 郑瑞玑 【摘要】 目的 研究异硫氰酸苯己酯（PHI）对淋巴母细胞性白血病Molt4细胞组蛋白乙酰化调控及诱导细胞凋亡的影响。 方法 采用MTT法观察PHI对Molt4细胞增殖的影响；流式细胞术观察细胞凋亡；olt4细胞株为模型，研究PHI诱导淋巴细胞系白血病细胞凋亡及其机制。 1 材料和方法 1.1 材料 PHI（美国 LKT Laboratories公司，批号：243－264），以75%甲醇配成5 mmol/L存储液。细胞培养用1640（美国Gibico公司）；胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）；Annexin V和PI双染试剂盒（美国BD公司）；Bcl2、Caspase3、Caspase9、Caspase8鼠单克隆抗体，PARP、βactin兔多克隆抗体，辣根过氧化物标记的羊抗鼠、羊抗兔的二抗，olt4细胞株（武汉大学典型物培养中心），用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液置37 ℃、体积分数为0.05饱和湿度的CO2培养箱培养，隔天换液传代培养，实验时取对数生长期细胞。 1.2.2 PHI对Molt4细胞增殖的影响 取对数生长期细胞，将其浓度调整为1.0×105 mL-1接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL，对照组使用75%甲醇，实验组分别加入PHI使终浓度为0,5,10,20,40 μmol/L，每组设6个平行孔，培养24,48,72,96 h后，每孔加入MTT（5 mg/mL）10 μL，继续培养4 h，离心后小心吸去上清，每孔加100 μL DMSO，充分震荡混匀，在酶标仪用双波长492 nm和630 nm测吸光度（D值）， 计算 细胞增殖率： 细胞增殖率（%）=（D实验-D空白）/（D对照－D空白）×100% 实验重复3次。 1.2.3 PHI对Molt4细胞凋亡的影响 用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基接种于75 mL培养瓶，每瓶接种2×106细胞，细胞浓度为2×105 mL-1，加入PHI使终浓度为0,5,20,40 μmol/L，作用3,7,14 h后收集处理后细胞。按试剂盒说明书操作后，立即行流式细胞术检测。 1.2.4 PHI对Molt4细胞组蛋白乙酰化、凋亡相关蛋白影响 细胞接种浓度及处理同前，收集细胞后，预冷PBS 0.06 mol/L洗涤2次，吸干洗涤液。按每1×106 细胞加入 100 μL 裂解液+1 μL酶抑制剂的比例冰上裂解细胞30 min，1 000 r/min 4 ℃离心10 min，吸取中间清亮层。Bradford法进行蛋白定量。以10％或12％的SDSPAGE电泳分离，半干电转移法转膜，室温下摇床封闭1 h，加入用TBS根据不同的一抗稀释不同的浓度，4 ℃过夜，TBS洗涤液洗膜后分别放入用TBS按1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗以及羊抗鼠二抗，室温下摇床作用1 h，TBS洗涤液洗膜后化学发光法显色，X射线底片曝光，以βactin为内参照，X射线胶片扫描后，AlphaDigiDoc 图像分析软件进行分析比较。 1.3 统计学处理 SPSS 11.5软件处理数据。常规进行方差齐性检验，正态性检验。计量资料实验数据以x±s表示。多组资料之间的比较采用单因素方差分析；方差不齐采用非参数检验。以Plt;0.05为差别有统计学意义。 2 结 果 2.1 PHI对Molt4细胞的增殖有抑制作用 不同浓度PHI作用后，Molt4细胞的增殖率随药物浓度的增加及时间的延长而逐渐下降，表现为明显的浓度和时间依赖性。 0,5,20,40 μmol/L PHI作用后，Molt4细胞的增殖率随药物浓度的增加而逐渐下降，表现为明显的浓度依赖性；20 μmol/L PHI作用后，Molt4细胞的增殖率随处理的时间的增加而逐渐下降，表现为明显的时间依赖性（图1A，B）。 2.2 PHI能诱导Molt4细胞的凋亡 PHI作用于Molt4细胞3，7，14 h后，流式细胞术结果显示PHI能诱导Molt4细胞凋亡，并具有时间和剂量依赖性（Plt;0.05，表1）。 2.3 PHI对凋亡相关蛋白的影响 olt4细胞3 h后，内源性途径的线粒体膜蛋白Bcl2，Caspase9及下游Caspase3凋亡底物PARP表达下降，而7 h下降趋势更明显，呈时效及量效关系；而配体受体途径的Caspase8未见明显变化（图2）。 表1 PHI对Molt4细胞早期凋亡的影响 2.4 PHI对组蛋白H3、H4乙酰化状态的影响 Molt4细胞在PHI作用下，组蛋白H3、H4乙酰化水平明显增高，呈量效和时效关系。