种子学（吕世琦）种子超低温贮藏133.pptVIP

种子超低温贮藏 农学133班 第四组 小组成员： 陈健泳 李梦娜 王 宏 王 睿 杨新晶 杨天成 目录 一.发展历程 二.概念及原理 三.方法及影响因素 四.优缺点评价 五.现状及前景 一.种子贮藏的发展历程 如今 1922年 1949年 1956年 1976年 1990年 H．E．Knowlton将金鱼草花粉冷冻到 － 180 ℃ 后， 仍获得一定程度的萌发率。 这是超低温冷冻保存植物种质的最早报告。 Polge 等首次利用二步法完成超低温保存（添加防冻保护剂，慢速降温） 日本科学家 A． Sakai首次报道耐寒桑树枝经冷冻脱水后超低温保存能存活。 M．Seibert首次报道麝香石竹茎尖超低温保存成功。 Sakai等建立了玻璃化冻存的简单高效的技术体系。 超低温保存技术在植物种质资源保存方面逐渐深入，已有近千种植物成功进行了超低温保存。 二.概念及原理 概念 超低温贮藏是指在－80℃以下的超低温中保存种质资源的贮藏技术。 原理 在低温下，调节和控制细胞生长代谢的各类酶的作用受到极大抑制，新陈代谢活动基本停止，处于“生机停顿”或“假死”状态。经过超低温保存后，处于“假死”状态的植物材料能保持正常细胞的活性、形态发生潜能和遗传稳定性，从而达到长期保存植物材料的目的，理论上可以无限期保存种质资源。 三.方法及影响因素 方法 依据冷冻源不同： 1.干冰(－79 ℃) 2. 超低温冰箱 3.液氮(－196℃)及液氮蒸气(－150~﹣180℃) 依据原理不同： 1、依据冷冻脱水的原理，结合程序降温的传统保存技术; 2、依据植物细胞玻璃化原理，采取快速降温方式的新技术。 基本流程 基本 流程 遗传稳定性分析 6 材料选择与准备 1 预处理 2 化冻 4 降温解冻 3 存活鉴定 5 1、材料选择与准备 由于材料的特性 ( 植物的基因型、抗冻性及细胞、组织和器官的年龄、生理状态等) 会影响超低温保存效果，因此，应根据植物种类，选择适宜进行超低温保存的不同材料类型，寻找适合液氮保存的种子含水量。 2、预处理 预处理目的主要是提高分裂相细胞的比例和减少细胞内自由水含量，使材料达到最适于超低温保存的生理状态。预处理的方法有低温锻炼和预培养。 3、降温冰冻 降温冰冻方式主要有 4 种： 快速降温、慢速降温、两步降温、逐级降温。 基本流程 基本流程 传统技术存活关键在于降温冷冻环节，而非脱水环节。主要为两步降温法，另外还有慢速降温法和逐级降温法等。 传统技术 新 技 术 影响因素 新技术存活关键在于脱水环节，而非降温冷冻环节。主要有包埋－干燥法、玻璃化法和滴冻法这 3 种。 4、化冻 因材料类型的不同以及处理方式的差异，其化冻方法也相应不同，主要有常温化冻、快速化冻和慢速化冻 3 种方法。其选择关键是防止化冻过程中细胞内次生结冰和化冻吸水过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏。。 5、存活鉴定 超低温保存后存活鉴定及评价指标与所用的超低温保存技术、材料类型及其再生方式有关，主要有存活率( 细胞活力快速染色法、再培养法等) 、再生率、萌发率、嫁接成活率、坐果率和结实率等。 6、遗传稳定性分析 保存后材料不发生遗传变异是种质资源保存的一个关键点。超低温保存中材料经受了一系列逆境胁迫，易诱导超低温保存材料及其再生植株产生变异。因此，必须在利用超低温进行常规大量长期保存植物种质资源前证实超低温保存后材料遗传稳定。 基本流程 材料的特性是影响超低温保存存活率和再生率的基本因素。植物材料对低温的耐受能力与植物的种属、基因型以及器官、组织和细胞的生理状态有密切关系。不同基因型的植物材料用同一种超低温方法保存后结果也不一样。 材料特性 处 理 影响因素 超低温保存各步的处理是影响超低温保存存活率和再生率的重要因素，每一步处理都会直接影响超低温保存效果。如低温锻炼温度及时间、预培养中蔗糖或渗透性化合物浓度及处理时间、装载液装载时间、冷冻保护剂类型及处理时间、再生培养基不同激素种类和比例以及光照处理等。 1)稳定 植物材料在-80℃的低温下，调节和控制细胞生长代谢的各类酶的作用受到极大抑制，新陈代谢活动基本停止，处于“生机停顿”或“假死”状态，此时植物材料能保持正常细胞的活性、形态发生潜能和遗传稳定性； 2)安全 超低温保存将尽可能避免组织、细胞继代培养及自然界中积累性突变等的发生； 3)长久 1903 年获得诺贝尔化学奖的瑞典物理化学家 Arrhenius 研究温度对化学反应速度的影响结果表明，低温能抑制生物体的生化活动，根据 Arrhenius 关系式可推算出生物材料在液氮( － 196 ℃) 下可