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水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 标准依据:GB/T 20361-2006 水产品中的孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法 实验原理 样品中残留的孔雀石绿或结晶紫用硼氢化钾还原为其相应的代谢产物隐性孔雀石绿或隐性结晶紫，乙腈-乙酸铵缓冲溶液混合提取，二氯甲烷溶液萃取，固相萃取柱净化，反相色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。 实验试剂与仪器 试剂 乙腈：色谱纯。 二氯甲烷：色谱纯。 酸性氧化铝：分析纯，粒度0.071mm-0.150mm。 二甘醇。 硼氢化钾。 无水乙酸铵。 冰乙酸。 氨水。 硼氢化钾溶液（0.2mol/L） 对甲苯磺酸（0.05mol/L）： 乙酸铵缓冲溶液（0.1mol/L）： 乙酸铵缓冲溶液（0.125mol/L）：用冰乙酸调pH到4.5。 酸性氧化铝固相萃取柱 PRS柱 标准品和标准溶液，注意低温避光保存。 仪器和设备 1、高效液相色谱仪：配有荧光检测器。 2、匀浆机 3、离心机：4000r/min 4、漩涡震荡机 5、固相萃取装置 6、旋转蒸发仪 实验步骤: 提取 称取5.00g样品于50ml的离心管内，依次加入10ml提取液，10ml乙腈，10000r/min匀浆，再向离心管中加入适量酸性氧化铝，振摇5min，4000r/min离心10min，上清液转移至100ml的离心管内。 另取一离心管盛10ml乙腈洗涤匀浆机刀头，将洗涤液并入第一离心管，沉淀物用玻璃棒捣碎，重复上述操作。 上清液合并至100ml的离心管，再向100ml的离心管加入2ml二甘醇，20ml二氯甲烷，振摇5min，然后4000r/min离心 10min，取下层液体至茹形瓶中，上层再加入15ml二氯甲烷，振摇5min，4000r/min离心10min，合并二氯甲烷层，35℃旋转蒸发至近干。 净化 将PRS柱安装在固相萃取柱装置上，上端连接酸性氧化铝固相萃取柱，用乙腈活化，一般需要活化3次以上，转移提取液到柱上，再用乙腈洗茄形瓶2次，每次2.5mL，依次过柱，弃去酸性氧化铝住，吹PRS柱近干，再不抽真空的情况下，加入等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液，收集洗脱液，再加入等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液，再次收集洗脱液，收集洗脱液用玻璃瓶，乙腈定容至3mL，供液相色谱测定。 色谱分析 液相色谱条件 色谱柱：C18柱，250mm?4.6mm，粒度5μm 流动相：乙腈+乙酸铵缓冲溶液 流速：1.3mL/min 柱温：35℃ 激发波长：265nm 发射波长：360nm 进样量：10μL 液相色谱测定 上机测定时，应根据样液中被测孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内。在上述色谱条件下，孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为6.10min、7.88min、17.77min、18.22min，标准品色谱图参见附录。 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的色谱图 实验过程中应注意： 匀浆时不要使匀浆机连续操作1分钟以上，因其发热，匀浆时间过长容易影响回收率和造成机器损坏，应停顿后再继续匀浆。 根据样品质量的多少来决定氧化铝的用量，5g鱼样大约需要10g氧化铝，若试样脂肪较多，应适当增加氧化铝的用量。 加入二氯甲烷后，进行液液萃取时，应上戴橡胶手套，一定要注意及时放气，应在通风处放气，放气口不要对着人。 过柱操作时，加入乙腈溶解茄形瓶中的残液时，应充分摇晃，使其溶解后再转移至固相萃取柱上。 实验过程中应注意： 液液萃取时，分液漏斗可改为比色管，用滴管取出上层液体，避免因使用分液漏斗时放塞过快导致二氯甲烷层流出。 进行净化时，活化的次数可以适当增加，一般不能少于3次。 净化操作应注意先移除氧化铝柱，再抽干PRS柱，避免氧化铝柱中有杂质抽进PRS柱中，造成污染。 洗脱操作为先碱洗，再酸洗，洗脱液因收集于同一容器，容器避免使用塑料瓶。 收集的洗脱液若发现存在浑浊，可适当稀释后进行离心操作。避免使用滤膜，因其易使未知物质混入洗脱液，导致污染。 影响孔雀石绿回收的因素： 二氯甲烷粹取次数 分液萃取时，静置分层的时间可长些，甚至可静置过夜 旋转蒸发时温度和时间的控制（35℃），过快会导致孔雀石绿被带出，影响回收率;蒸发太干，蒸发时间太长和蒸发温度高都会导致回收率降低 样品存放时间和温度（-18℃） 磺胺类药物在动物可食性组织中残留的高效液相色谱检测方法 试剂 蒸馏水 乙酸(优级纯) 甲醇(色谱纯) 二氯甲烷(分析纯) 正己烷(分析纯) 无水硫酸钠(分析纯) 碱性氧化铝柱 实验方法 称取5.00g样品，加入10g无水硫酸钠, 25mL乙腈,匀浆,4000r/min离心5min;