和标记生物素.ppt

生物素－亲和素免疫放大技术 姚 军 台州学院医学院医学检验系 概述： 70年代后期在免疫酶技术中利用生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin System BAS)标记抗体发展了又一种新型生物反应放大技术 第一节 生物素理化性质与标记 生物素（Biotin)有两个环状结构 I环（咪唑酮环）为与亲和素结合的主要部位 II环（噻吩环）为结合抗体和其它生物大分子的部位，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构 选择题 生物素分子中与亲和素结合的重要部位是（ ） A.咪唑酮环 B.苯环 C.吩噻环 D.羰基 E.-NH- 一、活化生物素 生物素侧链的末 端羧基经化学修 饰后制成带各种 活性基团的衍生 物－活化生物素 (生物素化衍生物) 生物素活化 选择题 用活性生物素标记的物质，下列哪项除外（ ） A.蛋白质的氨基 B.蛋白质的羧基 C.蛋白质的巯基 D.蛋白质的醛基 E.核酸 活化生物素 长臂活化生物素 (BCNHS) 是在生物素和 N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个 6- 氨基己糖分子基团，形成连结臂， 使其与抗体、酶等生物大分子结合后，不受位阻效应的影响, 更易发挥生物素的活性作用 选择题 4.常用于标记抗体的活化生物素是（ ） A.BNHS B.BHZ C.BCNHS D.BCHZ E.MPB 标记蛋白质醛基的活化生物素 生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白(Ag) 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接 后，再与无水肼反应而成。除醛基外， BCHZ还可标记氨基 选择题 .常用于偏酸性抗原标记的生物素是（ ） A.BNHS B.BHZ C.BCNHS D.BCHZ E.MPB 标记蛋白质巯基的活化生物素 马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB) 能特异地与蛋白质巯基结合的活化 生物素 标记核酸的活化生物素 光生物素(photobiotin) 侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后, 变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合, 形成B（生物素）-核酸探针 二、生物素标记蛋白质 活化生物素通过侧链与蛋白分子连接 一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性 对BNHS多标记抗体, BHZ则多标记偏酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变 可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后活性将降低 选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性 控制生物素:蛋白质比例 生物素:IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1 IgG应用浓度0.5~5μg/ml 1~3个生物素/1个Ag，3~5个生物素/1个Ab 使用交联臂减少空间阻力 第二节 亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记 亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合物 二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合 二、亲合素/链霉亲合素标记 标记物：酶、胶体金 异硫氰酸荧光素（FITC） HRP-AV(SA) 改良过碘酸钠法、戊二醛法 ABC/SABC 预制亲和素(AV)-Biotin、 链霉亲和素(SAV)-Biotin 第三节 生物素-亲合素系统的特点 一、灵敏度 二、特异性 三、稳定性 四、适用性 五、其他 第四节 生物素-亲合素系统的应用 生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强 生物素与亲合素各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性 使BAS及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献 一、生物素-亲合素系统基本类型及原理 BAB法（亲和素-标记生物素法）： 特点：以游离亲和素为桥臂，分别连接生物素化抗原（或抗体）和标记生物素（如酶标生物素） 选择题 BAB法中的“桥”是指（ ） A. 第一抗体 B.第二抗体 C.抗原 D.生物素 E.亲和素 BA法（标记亲和素-生物素法） 特点：以标记亲和素/标记链霉亲和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的游离亲和素（A），省却了加标记生物素（B-E）的步骤 BA法（标记亲和素-生物素法）：以标记亲和素/标记链霉亲和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的亲和素（A），省却了加标记生物素（B-E）的步骤 ABC法 　特点:将BAB法中的A（亲和素）先与B-E（酶标生物素）结合，制备成复合物ABC（亲和素-生物素-过氧化酶复合物） 方法应用 BSA在酶