实验七牛蛙骨髓染色体标本的制备与观察.pptVIP

牛蛙骨髓细胞染色体标本的制备与观察 一、实验目的： 1. 了解染色体的显带技术。 2. 学习中期染色体标本的制备原理。 3. 掌握骨髓细胞染色体的制备方法。 在物种进化、作物育种、性别鉴定、基因定位以及癌症和遗传性疾病的诊断中，需要制备染色体标本，进行染色体的详细分析。 染色体显带技术（banding technique） 讨论 染色体显带技术（banding technique） 是通过特殊的处理和不同的染色方法使染色体的不同区域着色，使染色体在光镜下呈现出明暗相间的带纹。 根据染色体的不同带型，可以更细致而可靠地识别染色体的特征。如G带、 Q带、 C带、R带、T带、N带等。 G带：将染色体标本用胰酶、尿素、去垢剂或某些盐溶预先处理，再用Giemsa染料染色，称为G带。富含AT区染色深。 C带：constitutive heterochromatin（结构异染色质）带的简称，可使着丝粒区、端粒区的异染色质及其他染色体区段的异染色质部分呈深染，其他部分浅染。 染色前需经酸、碱、盐处理，酸处理可使DNA脱嘌呤；碱处理可使DNA变性；盐溶液可使DNA骨架断裂。 由于异染色质包装非常紧密，基本不受酸碱盐的破坏，Giemsa染色深染。而常染色质区受到破坏， Giemsa染色浅染。 R带：与G带明暗相反（Reverse G-bands） 目前所用的R显带方法是RBG法 (R-band by BrdU using Giemsa)，即经BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）处理后用Giemsa染色。 意义： G带染色体的两末端都不显示深染，而在R带中则被染上深色，因此R带有利测定染色体长度和末端区域结构的变化。对揭示染色体末端缺失、重复、易位和断裂点的异常等有很高的价值。 东北梅花鹿染色体R带带型 NOR一般位于染色体的次缢痕部位，是rRNA基因（5SrRNA除外）部位。 硝酸银与NOR的蛋白质如nucleolin核仁素、numatrix核基质素结合，呈黑色银染物，这种银染阳性的核仁组织区称为Ag-NOR。 T带：专一显示染色体的端粒。 Giemsa显色原理： Giemsa染料是由亚甲蓝，天蓝和伊红组成的复合染料，除伊红外，均为噻嗪类染料，它与DNA中的PO43-结合而不与蛋白质结合。 其次取决于一个有助于染料沉淀物积累的疏水环境。染色体上高浓度疏水性蛋白的区域有利于噻嗪-伊红沉淀物的形成，经一系列处理后显示暗带，而另一些区域则为的亲水性蛋白质，对染料亲和力低，所以不显色。 染色体上与DNA结合疏松的组蛋白被胰酶分解，这些区域富含GC，染色浅；而组蛋白与DNA结合牢固的区段则被染成深色，这些区域富含AT。 有学者认为：相差显微镜观察未染色的染色体时，能直接观察到带的存在，说明显带现象是染色体本身具有的结构决定的。 本实验简要原理： 动物的骨髓中存在大量活跃的进行有丝分裂的细胞，是染色体制备的理想材料。 给动物注射特异作用于微管蛋白的秋水仙素后，可以抑制纺锤体的形成，使分裂细胞阻断于有丝分裂中期。 收集骨髓细胞，低渗处理，使细胞质膜破裂，以利染色体的分散。细胞经固定后，于预冷的载玻片上滴片，使染色体散开，再用姬姆萨染色，便可以制成染色体标本。 三、实验用品 试剂：0.65％生理盐水，甲醇—冰醋酸(3:1)固定液, 蒸馏水，Giemsa染液，自来水。 器材：显微镜，搪瓷盘，剪刀，烧杯，小离心管，玻璃注射器，染色缸，离心机，一次性手套，骨剪（实验班公用）。 材料：肉用成体牛蛙 四、动物的药物处理 牛蛙称重，按每克体重2微克的剂量腹腔注射秋水仙素溶液(用0.65％生理盐水配制)。注射后3.5~4小时，用过量乙醚或氯仿麻醉牛蛙。 五、实验步骤 接实验步骤： 2．小烧杯中加6ml 0.65％生理盐水，取带针头的注射器，从烧杯吸入2ml 生理盐水，将针头沿骨的长轴方向从骨的一端刺入骨中，缓慢推动注射器活塞，将骨髓细胞冲洗到小烧杯中。注意：冲洗时动作要徐缓，以免溶液喷出，损失骨髓细胞。此6ml的生理盐水要反复使用，直到把所有材料中的骨髓冲出为止。 3．将骨髓冲出物中大块白色脂肪组织用针头挑出，弃去。把6ml的骨髓细胞悬液转移至4只1.5ml离心管中（每管1.2ml，如体积不满，可再加入适量生理盐水，以保证离心平衡），3000转/分离心5分钟。 4．用移液枪小心地吸去上清液（弃去）。向每一离心管中加入75微升的0.65％生理盐水，用吹打的方法将沉淀物充分悬浮。将所有4管中的细胞悬液合并于一管，均分两份（每管150微升），以后操作每一组的两人各做一份。 5．在每管细胞悬液中加蒸馏水lml，吹打混匀