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多倍体诱发及细胞学鉴定 一、实验目的 1.通过实验掌握人工诱导多倍体植物的方法和技术，观察多倍体的特点 2.利用染色体分析的方法对多倍体细胞做出准确判断。 二、实验原理 ? 1.多倍体的发生 尤其是异源多倍体的产生是生物进化的重要途径之一。正常细胞的有丝分裂，在中期已复制为两的染色体，都集中于中央赤道板上，染色单体由于纺锤丝的牵引至后期分别趋向细胞两级。纺锤丝主要化学组成为蛋白质。一般认为蛋白质分子中的二硫键可以被细胞中辅酶的-SH（巯基）还原，于是由分子内的二硫键转变为分子间的二硫键，从而使蛋白质分子聚合。凡是能抑制巯基作用又能保持细胞活性的物质，就能阻止蛋白质分子聚合或使已构成纺锤丝的蛋白质分子间发生解聚作用，致使纺锤丝不能形成或断裂，从而消失，造成染色单体不能分向细胞两极，细胞质也不分离，复制的染色体仍存在于一个细胞中，结果染色体倍增。如果该细胞在下一次细胞分裂时又经药剂作用，则可产生更高倍数的细胞，（一般成等比级数增加，但也会出现奇数倍或非整倍现象，且由于药物的毒性作用染色体不会无限止的增多），这样就形成了多倍性细胞。在药剂作用的过程中，由于同一组织中的不同细胞有丝分裂的不同步性，而出现加倍程度不一的表现，这种现象称为混倍性（混倍现象）。经加倍了的细胞，一旦停止药剂作用，仍能进行正常的有丝分裂。由此而产生的子细胞，一般说都是多倍性细胞，从这种细胞分化出来的植株，就是多倍体。 2、诱发药物 人工诱发多倍体的方法很多，分为物理的（变温、机械损伤、射线处理等） 和化学的，如：各种植物碱、麻醉剂、植物生长激素等 秋水仙素是诱导多倍体的最有效的方法之一，它具麻醉作用，性极毒，易溶于酒精、氯仿、甲醛和冷水中，不易溶解于乙醚、苯中。 秋水仙素的作用： 1）细胞分裂时抑制纺锤体的形成 2）抑制细胞板的形成 3）无残效 3．诱导方法 1）种子浸渍处理 2）毛细管法 3）羊毛脂法 4）球根处理 5）复合处理 6）离体组织水平上诱导单个细胞内染色体加倍 4、多倍体植物的特性 1）巨大性 2）可孕性低 3）适应性强 4）有机合成速率增加 5）克服远缘杂交的不结实 5、鉴定方法 ? 植物多倍体的鉴定有两种方法：一是直接鉴定法，又叫细胞学鉴定法，即直 接计数细胞内的染色体数目而鉴定其加倍的倍数；二是间接鉴定法：通过测量叶 片、气孔、保卫细胞及花粉粒大小等外部形态间接鉴定是否属于多倍体。 三、实验材料 ??蚕豆（Vicia faba）根尖??? 四、实验用具、药品  生物显微镜、剪刀、镊子、解剖针、载玻片、小玻璃瓶、恒温箱、0.1%-0.2%秋水仙碱溶液、卡诺固定液、纯净水、1mol?1-1盐酸等。 五、实验步骤 1.?取材： 取大蒜（洋葱、蚕豆、小麦等）发根至0.5-1cm，然后转入盛有0.15%秋 水仙素水溶液的培养皿中继续培养24小时，待观察到根部有膨大时取出固定。与在水中培养的材料做对照。 （一般植物生长周期17-18小时，） 2.?固定： 在卡诺固定液中固定24小时，移至70%乙醇中保存或备用。 3.解离： 植物的分生组织如根尖、茎尖等需要经过处理以便除去细胞之间的果胶层 并使细胞壁软化，经解离的组织才能使压片步骤顺利进行。解离常用酸解法和酶解法。 ①酸解法：固定后的材料用清水洗涤后，用1MHCl在60℃水浴中恒温处理5-10min。在酸解过程中一定要掌握好温度和时间，若解离不够，则压片不易分散。若解离太过，在下一步处理材料时由于材料过软而易丢失。然后水洗3次。 ②酶解法：用10-20g/L的果胶酶，或与10-50g/L的纤维素酶混合使用。 4.染色.： 切取根尖分生组织区，用改良苯酚品红染色15 min。 5.压片： 将染色后的材料盖上盖玻片，在盖玻片上盖上两层吸水纸，用一个双面刀片，插到盖片与载片之间的一角，用左手食指压紧盖片，防止滑动，用右手持解剖针，用针柄轻敲盖片，使材料均匀分散开。然后将刀片轻轻撤出，再用针柄重敲盖片，使细胞分散压平。 6. 镜检： 1）在制成的染色体玻片标本中，染色清晰而且分散良好的中期分裂相总是少数，所以，在压片之后需要认真地进行镜检。 镜检时先用低倍镜进行观察，找到好的视野后再转用高倍镜观察。 一张制片好的细胞染色体制片至少符合如下条件 ①在一张制片中应有较多的中期分裂相。 ②染色体分散而不重叠。 ③染色体不扭曲、断裂、主缢痕、随体清晰。 ④制片基本上为一层平展的细胞，视野内的细胞都在一个平面上。 染色体着色较深而细胞质不着色或着色很浅，背