限制性核酸内切酶Bsp 631特性的研究1).pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing) 7(5):9-111985 研究报告 限制性核酸内切酶Bsp631特性的研究’‘ 曹新文 李冠一 黄宁悟 董 群 邹国林 朱汝播 武（汉大 学生物系） 11型限制性核酸内切酶的发现和应用，革 海制药厂产品），pBR322DNA 上（海生物化学 命性地推动了分子生物学和遗传工程的发展。 研究所产品），其它试剂均为分析纯。 不管从酶本身的理论研究或从工具酶的应用研 CBsp63I酶的分离与纯化 另文报道。 究方面来说，都必须首先确定酶促反应系统的 ，。酶活性的定量测定 酶0.5川，TM缓 最适条件以及各种因素对酶活性的影响，但是 冲液 5（0mMTris-HCI,pH7.5,10mMMgCl,) 目前关于这类酶促反应条件的确定，多数是根 30ul,pBR322DNA21zl(0.5Fcg)，总体积32.5 据定性实验和经验，很少是根据定量实验作动 户。37℃保温20分钟后，加 10川终止反应液 力学描述。 (200mMEDTA,0.05%澳酚蓝，50%甘油）， 限制性核酸内切酶Bsp631是我国自己分 然后进行琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶浓度为 离的菌种和发现的新酶Ci]。已测定其识别序列， 1.2多，每毫升凝胶含澳化乙锭 0.5/zg，电泳缓冲 并确定它是 PstI酶的异源同功酶。根据我们 液为 89mMTris,89mM硼酸，pH8.5,25mM 对这两个异源同功酶的比较研究，我们认为 EDTA。如为盘状电泳，则电流每管为2-3 Bsp631比PsA有较多的优点：酶含量较高，且 mA，如为卧式平板电泳，则为6V/cm。电泳完 比较稳定，易于纯化。因此，估计可用Bsp631 毕后，在254nm紫外灯下观察。加红色滤光片 取代PstIo但对Bsp631酶性质的研究，国内 照像，通过测产物带的黑度定量测酶活。 外尚未见报道。因此我们采用本实验室自己纯 6．各种因素对酶活性影响的测定 除 化的Bsp631酶，用定量测活的方法，对其最适 pH因素是用 50mMNa,HPD,,-KH,PO,缓冲液 反应条件，二价阳离子及一价阳离子对其活性 代替TM缓冲液外，其它因素对酶活性影响的 的影响，以及酶的Km值等进行了初步的研究， 测定所用缓冲液均为TM缓冲液。测定温度的 从而为今后对该酶的动力学研究结构分析及其 影响时，温度的范围是从 25℃到609C,侧定 作为工具酶的应用提供了必要的资料。 Mbg++浓度的影响时，是在TM缓冲液中，配制 含各种不同浓度的Mg++(2,5,10,20,30,50, 材 料 与 方 法 100niM)o测定无Mg+＋存在下各种二价阳离子 1.菌种 Bacillus树aericus631上（海生 (Mn++,Ca＋十，Cn++sCo++Fe++Zn++)或一价 物化学研究所严佩芳等同志赠送）。 阳离子的影响时，是在缓冲液中配制各种分别 2．细菌培养 另文报道。 3．试剂 肝素琼脂糖和 CibacronBlue CaoXtnwen eta1.:Characterization ofRestrictionEndo- nucleaseBsp631 F,GA-琼脂糖 本（实验室自制），琼脂糖 上（海东 1]中国科学院科学基金资助的课题。 9 含不同浓度的二价阳离子或一价阳离子，其浓 为37℃左右21〔，但并不完全一样，有的甚至相差 度范围与Mg++相同。侧定有 吨＋＋存在下 十分悬殊，例如 BclI的最适温度为500C,BsiE NaCl或 KCl浓度的影响时，