石斛属植物rbcL基因序列变异和系统发育初步研究.docVIP

　　石斛属植物rbcL基因序列变异和系统发育初步研究 【摘要】 目的探讨10种石斛植物叶绿体rbcL基因序列变异和系统发育关系。方法根据Genebank已经公布的植物rbcL基因序列设计一对引物，用于石斛rbcL基因PCR扩增。基因序列排列用Clustal X软件完成，应用Seqnconverter软件分析序列的长度、GC含量、GpC量、GCskeaximum parsimony method）获得最大简约系统树；应用自展法（bootstrap）检验系统树，自展次数为1 000次。结果10种石斛植物叶绿体rbcL基因的长度范围为944～950 bp，其中536 bp为保守位点，466 bp为变异位点，439 bp为具有系统发育信息的信息位点。基因中GC含量为40.61%～41.37%，GpC含量为4.03%～4.78%，GCske plants. MethodsA pair of primers plify the rbcL gene. Gene sequence, the contents of G+C, the contents of GpC, the value of GCskeaximum - parsimony (MP) method. Bootstrap analysis plings of the data set. Results944～950 bp nucleotides Dendrobium plants. Conserved sites, variable sites and phylogeically informative sites phylogeny. 　　Key ; rbcL gene; Sequence analysis; Phylogeny 　　石斛是我国传统贵重中药材， 现代 药理研究证明其具有增强免疫、抗肿瘤、抗衰老、 治疗 白内障等作用［1］。由于石斛属植物集药用和观赏于一体，被过度地开发利用，加上生境的破坏及自身生长缓慢等原因，石斛野生资源濒于绝灭。迄今为止，石斛属植物的研究已在形态学、比较解剖、植物化学、同工酶和等位酶等方面积累了许多资料［2，3］。运用PCR和DNA测序等方法，从分子系统学角度对石斛进行研究也有一些报道，所选择的基因包括matK基因［4］和rRNA基因［5］。l，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）是一种具有羧化和加氧双重功能的酶，在光合作用和光呼吸中都起着重要作用。Rubisco酶由15个亚基组成，包括8个大亚基和8个小亚基。其中大亚基基因（rbcL）由叶绿体基因组编码，小亚基基因（rbcS）由核基因组编码，其中rbcL基因已经成为分子系统学研究中使用最为广泛的分子指标之一。为此，本文尝试对10种石斛植物rbcL基因进行测序并分析，旨在为研究石斛植物的系统发育提供核苷酸序列方面的证据。 　 　1 材料 实验所用石斛植物采自云南的原始森林，现被整丛栽种于山东理工大学生命 科学 学院植物组织培养实验室以便及时取材和观察。见表1。 　　 2 方法 　　2.1 总DNA的提取 　　取各样品新鲜原植物的叶片，采用改良的CTAB法提取基因组DNA［6］，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，并在紫外分光光度计下检测其浓度，稀释标定到10 ng/μl，放入-20℃冰箱里储存备用。 　　2.2 rbcL-PCR反应体系 　　PCR反应在PTC-200型梯度热循环仪上进行，PCR扩增反应总体积为50 μl，其中包括50 mmol/L KCl，10 mmol/L TrisHCl (pH 9.0)，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，50～100 ng基因组DNA，1U Taq聚合酶和0.1 μmol/L引物。根据Genebank上已经公布的植物rbcL基因序列设计一对引物，用于rbcL基因片段PCR 扩增，其中上游引物P1为：5′-GAG AGA CTA AAG CAA GTG TTG GA-3′，下游引物P2 为：5′-ATG ATC TCC ACC AGA CAT ACG A-3′。引物由上海生工生物技术有限公司合成，PCR扩增程序为94℃变性3 min；94℃ 50s，56℃1 min，72℃1 min，循环35次，72℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用Alpha 2200凝胶成像系统观察结果。 　　2.3 PCR产物的纯化与测序 　　使用上海生工公司柱式DNA胶回收试剂盒进行回收，由博尚生物技术有限公司测序，测序引物与PCR反应引物相同。 　　2.4 数据处理 　　基因序列用Clustal X软件排列，应用Seqnconverter软件分析序列的长度、GC含量、GpC量、GCskeaximum