磷脂双分子层辅助的疏水氨基酸的缩聚研究.docVIP

　　磷脂双分子层辅助的疏水氨基酸的缩聚研究 【摘要】 目的： 研究 磷脂双分子层对疏水氨基酸色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸缩聚反应的 影响 。 方法 ：活化氨基酸的聚合反应在囊泡体系和对照缓冲溶液中进行，反应产物用高效液相色谱_质谱联用仪进行分离检测。结果：两种体系中都有氨基酸的缩聚产物_寡肽的生成。结论：对磷脂双分子膜亲合力较强的氨基酸，磷脂双分子层对其缩聚反应显示了明显的辅助作用。 【关键词】 磷脂双分子层 氨基酸 寡肽 缩聚反应 　　［Abstract］Objective: To investigate the effect of lipidic bilayers on the polycondensation of hydrophobic amino acids(trptophan, phenylalanine, methione, leucine, isoleucine, and valine). Methods: The polycondensation of amino acids in liposome system as amino acid_N_carboxyanhydrides(NCAs). The reaction products ino acid_NCAs oligomerize into polypeptides in both systems. Conclusion: The presence of lipidic bilayers can assist the polycondensation of amino acids to varying extent depending on thEir membrane affinity. 　　［Key iller模拟远古条件合成了氨基酸，从而走出了分子进化的第一步［1］。但低分子量的分子还没有解决生命如何起源的 问题 ，需要进一步探讨功能化大分子(如蛋白质和核酸)的形成［2］。有报道，过磷脂双分子层(囊泡)对色氨酸的缩聚反应有明显的辅助作用［3,4］。本文将系统研究疏水氨基酸色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、蛋氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)的缩聚反应，通过比较不同结构的疏水氨基酸在磷脂双分子层体系和对照缓冲溶液中的反应， 总结 氨基酸与磷脂双分子层的相互作用对氨基酸缩聚反应的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器与试剂 　　HP1050 LC高效液相色谱(HPLC)_HP1100 MSD质谱(MS)联用仪(惠普公司，美国)。棕榈硬脂酰磷酯酰胆碱(POPC)和11′_羰基二咪唑(CDI)(Sigma_Aldrich公司，美国)。氨基酸及其它试剂均为 分析 纯。 　　1.2 方法 　　POPC囊泡体系的制备、氨基酸_N_羰基_环内酸酐(氨基酸_NCA)的聚合反应以及HPLC和MS分析方法［4］：将POPC溶解在氯仿中，常压旋转蒸发除去溶剂，隔夜真空干燥；然后加入一定量的咪唑(0.4mol/L)/盐酸(对照)缓冲溶液(pH　6.80)，分别在液氮中冷冻、40℃水浴中解冻，重复冷冻解冻过程10次制得POPC囊泡体系。将氨基酸(40mmol/L)溶解在对照缓冲溶液中；氨基酸溶液与过量2.5倍的CDI在0℃下反应2min；得到的氨基酸_NCA溶液(40mmol/L)将其分别与对照缓冲溶液和POPC囊泡体系(40mmol/L)按1∶1(v∶v)混合，在室温下震荡12h，得到的产物用HPLC_MS联用仪分离检测，其条件同 　　将新鲜制备的氨基酸_NCA溶液与对照缓冲溶液和POPC囊泡体系混合，在室温下振荡12h。此时MS 分析 检测不到氨基酸_NCA和N_咪唑羰基氨基酸，说明氨基酸_NCA的聚合反应完成。反应产物用HPLC和MS进行分离和检测。典型的Phe缩聚产物的HPLC图见图2，从中可以看到明确分离的组分峰。由MS检测可知组分峰为寡聚Phe，其聚合度用数字在每一组分峰上部标出。通过测量组分寡肽峰在215nm(寡聚色氨酸在280nm下测量)的吸光度值且对时间积分可以近似对寡肽的产率进行定量分析(假定每个氨基酸单体的摩尔吸光系数在聚合成寡肽后近似不变)。各氨基酸缩聚后生成的寡肽的组分峰面积(对应寡肽的产率)随聚合度变化的关系见图3。　　图2 缓冲溶液(A)和POPC囊泡体系(B)中寡聚Phe产物的HPLC色谱图（略） 　　Fig.2 HPLC chromatograms of products of oligo_Phe in reference buffer(A)and in liposome(B) 　　图3 POPC囊泡对不同氨基酸的缩聚产物色谱峰面