基因操作及其医学应用1讲义.ppt

DNA的生化特性 DNA的生化特性 DNA 的生化特性 RNA 的生化特性 mRNA mRNA占细胞RNA总量的1%～5%，分子量范围几百～2万个核苷酸，变化大（RT/PCR）。原核和真核生物mRNA的结构不同。 tRNA 各种物种的tRNA均含有73～93个核苷酸，一端是CCA结合氨基酸部位，另一端为反密码子环。tRNA通晓mRNA的核苷酸语言和蛋白质的氨基酸语言（AARS），是蛋白质翻译的译员。 RNA 的生化特型 What is the Gene? 基因（gene） 是核酸贮存遗传信息的遗传单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。该顺序可以产生或影响某种表型，可以由于突变生成等位基因变异体。 基因组的基本结构 基因组（genome） 指细胞或生物中，一套完整单倍体遗传物质的总和，包括全套基因及间隔序列。 人类基因组包含22条常染色体和XY两条性染色体上的全部遗传物质（核基因组）以及线粒体上的遗传物质（线粒体基因组）。 原核基因组和真核基因组 真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，具有许多复制起始点，每个复制子大小不一 人类染色体单倍体DNA全长3×109bp，含3~4万个基因。 大肠杆菌DNA全长4.6?106bp，含4000个基因。 原核基因组 Prokaryote Genome 原核生物基因表达的调控 原核生物基因表达的调控方式最重要的特点是操纵子模式。主要通过及时调整酶系统基因表达以适应环境，获取营养。 调控水平主调在转录水平，翻译水平次之。 真核生物基因表达的调控 真核生物基因调控远比原核生物复杂，绝大多数真核生物基因极少数与环境变化有直接或间接的关系，其调控最大特点是遗传程序调控。 调控主要水平是转录水平。其次为转录后水平、DNA水平、翻译及翻译后水平等。 2.DNA体外重组 常用的工具酶（tool enzymes） 限制性核酸内切酶（resriction enzymes,restriction endonadease) DNA连接酶（DNA ligase,ligase) 逆转录酶(reverse transcriptase) DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol) 核酸酶(nuclease) 末端转移酶(terminal transferase) 碱性磷酸酶(BAP或CIP) 质粒的分类 克隆载体(cloning vector)都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。 表达载体(Expression vector)具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等），还具有转录/翻译所必需的DNA顺序。为了有效的转录，必需有强大的能够被宿主细胞识别的启动子。 人工构建质粒载体必备条件： 较小分子量和松弛复制子，都能独立自主的复制； 基因组上有一到两个筛选标记，都能便利的加以检 测（抗生素抗性）； 有一到数个限制性内切酶位点，容易引进宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化（提质粒）。 理想条件：插入失活筛选标记 3）.目的基因片段与载体的连接 5．外源基因表达 克隆基因在原核细胞中表达 克隆基因在哺乳动物细胞中表达 克隆基因在其它表达系统中表达 昆虫表达系统 酵母表达系统 真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳动物细胞） 优点：能转录后加工，即能剪接内含子；能翻译后加工，即能糖基化修饰等；通常不形成包涵体，能正确折叠。 缺点：但技术难度较大，成本较高，表达量较低。 ④ 斑点杂交 ( Dot Blots ) 　　　　 已知重组DNA 　　　　　　滤膜 　　　重组DNA同源性和特异性 方阵打点 阳性重组DNA探针杂交 基因操作的基本策略 　⑤ southern杂交 　　　　DNA片段吸印 　　　　重组探针杂交 　　　　后处理 在原核表达体系（以Ecoli为代表）： 优点 1.遗传背景清楚,易于调控; 2.表达技术经典成熟,应用广泛,目前无以取代; 3.目的基因表达水平高, E.coli培养周期短，“物美价廉”. 缺点 1. 缺少真核蛋白质翻译后加工修饰系统,如剪切,糖基化,及正确二硫键形成等; 2. 表达蛋白质多以包涵体形式存在,需经复性才能 恢复构象与活性. 3. 宿主本身杂蛋白质多,纯化步骤复杂,故某些蛋白质,特别时糖蛋白或脂蛋白, 酌情选择真核表达载体。 目的基因高效表达 三个因素： 强化蛋白质的生物合成 抑制蛋白质的降解 恢复蛋白质的空间构象 * GENE MANIPUTATION AND ITS APPLICATIO