基因直接进化研究进展——DNAShuffling技术[毕业论文].ppt

基因直接进化研究进展 ——DNA Shuffling技术 生物的自然进化 进化过程： 突变→自然选择→遗传后代 进化结果： 基因多样性：为完成同一功能所表现出的 多个 基因或同一个基因(同源性) 代谢途径的多样性：同样产物，多条途径 代谢产物的多样性：同一底物，不同产物 生物多样性：整个生态系统中的生物 人工获取新基因的方法 常规的基因工程方法 生物功能 蛋白质 基因 新基因的理性设计和人工合成 根据已有基因的序列和功能进行设计 基因的直接进化（directed evolution) 可使已有基因获得新的特性 可获得自然界中不存在的基因 可解决许多新的理论和应用问题 基因直接进化的步骤 突变 基因突变库的建立 筛选 基因突变库的活体或离体筛选 基因复制与遗传 建立基因突变库的方法 定向诱变： 点突变——碱基删除、增补和替换 随机诱变： 易错PCR法(Error-prone PCR)—— 降低一种dNTP的量（降至5％-10％） 加入dITP来代替被减少的dNTP 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ 易错PCR 同序法（consensus approach） 真菌植酸酶aa序列的同序比较 DNA Shuffling: 外显子、单基因和基因家族的重组装 随机引物延伸法 交错延伸法 随机片段活体突变: 线状基因和随机片段共转化酵母细胞 平板分析 使抗生素失效的酶类(如头孢菌素酶，b -乳糖酶） 提高耐热性 易于观察的菌落表型（如菌落颜色等） 营养缺陷型的辅助筛选 随机引物PCR和重组装 分子进化工程的应用 单基因的定向改造 序列相关基因的重排 生物代谢途径的改造 对整个基因组的改造 药物的筛选 枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化（Huimin Zhao等，1999） 进化后的枯草杆菌蛋白酶E 正面 反面 耐热p-硝基苯酯酶的分子进化(Lori Giver等，1998） β-葡糖苷酶耐热性的提高 (Mary′a Jesu′ s Arrizubieta等，2000） Evolution of a cytokine using DNA family shuffling Chia-Chun J. Chang ……. Phillip Patten Nature Biotechnology Vol. 17, August, 1999 Aims of the work: Demonstration of usefulness of the DNA shuffling tool for rapidly evolving human a interferon towards improving antiviral property Interferons (IFNa, IFNb, IFNg) Reasons for their limited use as drugs: IFNas are produced by monocyte, macrophages and other cells upon stimulation by virus. IFNs are able to protect cells from viral infection by reacting with IFN receptors on the cell which triggers a series of signal transduction events, hence immune response. IFNs suppress an exaggerated growth potential of cancer cells. IFNs can be used as drugs in the treatment of viral infection. Only one natural IFN-a, Hu-IFN-a2, in clinical studies. Most active engineered IFN-a, alfacon-1, is a consensus of 13 wild type Hu-IFN-a genes that is used in hepatitis C therapy. Dose-limiting toxicity, Receptor cross-reactivity, Short serum half-