腺病毒介导的 p53 基因对人肝癌细胞抑制作用的实验研究.docVIP

　　腺病毒介导的 p53 基因对人肝癌细胞抑制作用的实验研究 作者：田耕 刘积良 董洪松 陈伟红 谭淑瑜 【摘要】 目的：研究重组腺病毒介导的野生型 p53 基因对人肝癌细胞系 HepG2 的抑制作用。方法：用 MTT 比色法检测重组人 p53 腺病毒（Ad-p53）在不同感染滴度、不同感染时间对人肝癌细胞 HepG2 生长的抑制作用，用流式细胞仪检测 Ad-p53 作用后 HepG2 细胞的凋亡率；采用瘤内注射的方法观察 Ad-p53 对裸鼠移植瘤的抑制作用。结果：Ad-p53 对HepG2 细胞有明显的抑制效应，效靶比（MOI）越高、作用时间越长，抑制作用越强；当 rAd-p53 在 125 MOI 效靶比时，细胞生长基本达到完全抑制；p53 转导显著增加了 HepG2 细胞的凋亡率；瘤内注射 Ad-p53 后，荷瘤裸鼠的肿瘤生长受到明显抑制。结论：Ad-p53 对人肝癌 HepG2 细胞有明显的抑制效应，其抑制效应具有时间、剂量依赖关系，Ad-p53 转导野生型 p53 基因可能是一种有效的肝癌基因 治疗 途径。 【关键词】 肝癌；腺病毒； p53；基因治疗 〔Abstract〕 Objective To explore the potential use of adenovirus mediated p53 gene (Ad-p53) therapy for hepatocellular carcinoma. Methods A human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 or nodules in vivo. The groa nodules in nude mice ined. Cell apoptosis etry method. Results Cell grooral injection of Ad-p53 significantly inhibited hepatocellular carcinoma implanted xenograft. Conclusion Transfection of a. 〔Key I-1640 培养基传代培养。5~7 周龄 BALB/c 裸鼠，雌性，体重 18~21 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于无菌塑料透明隔离器内，动物实验时严格无菌操作。 1.2 MTT 法检测病毒感染滴度与细胞存活的关系 将 HepG2 细胞按每孔 500 个细胞分别接种于 96 孔板内，第 2 天用 Ad-p53 分别以 10、25、50、75、100、125、150 效靶比（multiplicity of infection, MOI）感染细胞，对照组不加药，每一 MOI 值重复 6 孔。37℃，5% CO2 饱和湿度培养箱中培养 10 h 后弃去病毒感染液，换新鲜培养液，每孔加入 50 g MTT，孵育 4 h 后二甲基亚砜（DMSO）终止反应，酶标仪测定光吸收度。 1.3 MTT 法检测病毒感染时间与细胞存活的关系 将 HepG2 细胞按每孔 500 个细胞分别接种于 96 孔板内，第 2 天用 Ad-p53 以 125 MOI 感染细胞，对照组不加药，每一时间值重复 6 孔。37℃，5% CO2 饱和湿度培养箱中分别培养 30、60、90、120、150 min 后弃去病毒感染液，换新鲜培养液，24 h 后换新鲜培养液，每孔加入 50 g MTT，孵育 4 h 后 DMSO 终止反应，酶标仪测定光吸收度。 1.4 台盼蓝染色绘制细胞生长曲线 将 HepG2 细胞 1×105 接种于 60 mm 的平皿，培养到约 70% 汇合，细胞计数，吸出培养液，125 MOI 值的 Ad-p53 和空载体腺病毒 Ad-LacZ 感染 HepG2 细胞，设空白对照，每天观察细胞生长状况，于感染的 2、4、6、8 d，用 2.5 g/L 胰蛋酶消化细胞，离心收集细胞，台盼蓝染色，细胞计数，每皿重复 3 次，取平均值，绘制细胞生长曲线。 1.5 Annexin V/PI 双染色法检测细胞凋亡 分别取 5×105 个对数生长期 HepG2 接种于 6 孔板， 125 MOI 值的 Ad-p53、Ad-LacZ 及 PBS 作用 24 h 后收获细胞，每个标本加入 Annexin V 2 L、PI 荧光抗体 2 L，室温避光双染色 15 min，加入 400 L 结合缓冲液，上流式细胞仪检测分析，获得标记阳性的细胞， 计算 细胞凋亡率。 1.6 Ad-p53 对裸鼠移植瘤生长的抑制作用 HepG2 细胞在 37℃，5% CO2，含 10% 小牛血清的 RPMI-1640 的培养基中培养，将处于对数生长期的细胞用 0.