牛冠状病毒N基因的原核表达及初步应用.pdfVIP

76 中国人兽共患病学报 2010 , 26 (1) Chinese Journal of Zoonoses 文章编号: 1002-2694(2010)01- 0076- 05 牛冠状病毒 N 基囚的原核表达及初步应用铸 刘合义，余丽芸，侯喜林，孙留霞，周玉龙，王进轶，刘汉翼，朴范泽 摘 要:目的 获得牛冠状病毒 N 基因的全长序列，实现 N 基因在大肠杆菌中的高效表达，并进行初步应用。方法 根 据已发表的牛冠状病毒 Mebus 株的序列设计引物，对 BCV-DQ 株进行 RT-PCR 扩增、克隆和测序s 将该基因插入到原核表达 载体 pET-30a (十)上进行原核表达 .SDS和 Western blot 检测 s 用纯化的重组 N 蛋白作为包被抗原，建立 ELISA 检测 方法，对部分l临床样本进行检测。结果 配V-DQ 株 N 基因全长 1347坤，与 GenBank 已发表的 6 株配V 的 N 基因相比较， 核普酸同源性 98.3% 以上。构建的重组质粒 pET-N 能表达出一条大小约为 60 ku 的蛋白，且能与鼠抗 BCV 血清发生特异性 反应。用建立的 ELISA 方法对黑龙江不同地区送检的共 256 份牛血清样品进行检测，结果阳性率 65.23% ，与病毒中和试验 的符合率达 95.31% 。结论 BCVN 基因保守性很高，并在原核表达系统中获得了高效表达，其表达产物具有良好的免疫反 应原性。临床检测结果表明 N 蛋白可作为诊断抗原用于牛冠状病毒病的流行病学调查。 关键词:牛冠状病毒 ;N 基因 g 克隆g 序列分析s 原核表达 中图分类号:8852.65 文献标识码:A Prokaryotic expression of the nucleocapsid protein gene in bovine coronavirus and its preliminary application LlU H e-yi , YU Li-yun , HOU Xi-lin , SUN Liu-xia ,ZHOU Yu-long ,WANG Jin-yi , LIU Shuang-yi ,PIAO Fan-ze (Animal Technology College 0/ Heilongjiang August First Land Reclamation University. Daqing 163319.China) ABSTRACT: To obtain and analyze the sequence of the nucleocapsid gene from bovine coronavirus. and to produce the fu- sion protein of the N gene in E. coli in order to use this recombinant protein for the study of bovine coronavirus. The N gene of BCV-DQ strain was amplified by RT-PCR. in which the primers were designed on thc basis of N gene sequence of BCV-Mebus strain. The PCR products of 1 347 bp in length were cloned and sequenced. and then inserted into the prokaryotic vector pET30a. The recombinant plasmids were then transformcd into Escherichia coli BL21 and identified by SDSand