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细胞生物学技术 刘 红 亮 2006.10.14 细胞生物学技术 掌握显微镜技术和细胞培养技术（重点） 了解常用技术的步骤及其目的（重点） 了解新技术及其使用目的 第一节 显微技术 光学显微镜技术（重点） 电子显微镜技术 显微操作技术光学显微镜技术 普通光学显微镜 1. 构成： 照明系统 光学放大系统 机械装置 概念－分辨率 分辨率：指分辨物体间最小间隔的能力。 R=0.61λ/N．A． 其中λ为入射光线波长；N．A．为镜口率 ＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 思考：如何提高显微镜的分辨能力？ 表一、几种介质的折射率 显微镜的几个光学特点 以可见光为光源的显微镜，空气为介质，分辨率为0.2μm 人眼的分辨率为0.1mm,所以光学显微镜的设计放大倍数为500 通常将普通光镜下所见物体的结构称为显微结构 光学显微镜的辅助技术 染色 固定 切片 倒置显微镜 inverse microscope 物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。 莱卡倒置显微镜 荧光显微镜 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光 另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光 荧光显微镜就是对细胞内这类物质进行定性和定量和定位研究的工具之一。 荧光显微镜的特点 光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。 荧光显微镜照片 相差显微镜 相差显微镜由P．Zernike 于1932年发明，并因此获1953 年诺贝尔物理奖。 这种显微镜最大的特点是可以观察未经 染色的标本和活细胞。 暗视野显微镜 聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 利用这种显微镜能见到小至 4~200nm 的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50 倍。 适合观察细胞内的细胞核、线粒体以及液体介质中的细菌和真菌 显微摄影技术 细胞运动很慢难以在短时间内观察 一定时间间隔自动拍摄记录，已正常速度放映，加快所拍摄情节 观察活细胞的运动 激光共聚焦扫描显微境  用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，检测发射荧光和荧光标记物质的三维结构 激光共聚焦扫描显微镜 当代显微镜的发展趋势 进入20 世纪80 年代以来，光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展，其发展趋势主要表现在，注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、摄影装置于一体，从而操作灵活，使用方便。 电子显微镜技术 电子显微镜以电子束为光源，光学显微镜以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源。 电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前TEM 的分辨力可0.2nm。 在光学显微镜下无法看清小于0.2μm 的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超微结构 电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本需要用超薄切片机制作厚度约50nm 左右的超薄切片。 透射电子显微镜 电子显微镜通常指透射电子显微镜transmission electron microscope，TEM 镜桶内是真空，避免电子与空气中的分子碰撞而发生散射 样品密度大的地方电子散射多形成暗区，反之形成明区 样品需要固定，切片，浸染，然后放在载网上观察 样本的反差决定于组成分子的原子序数，原子序数越高反差越大，生物分子的原子序数低，所以用重金属如锇铀铅等盐类浸染 细胞的不同成分对盐类有不同的亲和力，根据观察的目的确定浸染盐类，锇对脂质有较高的亲和力，常在观察膜性结构是浸染标本 增强电压可以观察较厚的样品，由此产生了高压电镜 内质网透射电镜图 电镜辅助技术 超薄切片通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20~50nm，切片采用重金属盐染色，以增大反差 负染技术负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm 左右 冰冻蚀刻冰冻蚀刻亦称冰冻断裂。 标本置于-