远志种质资源遗传多样性随机扩增多态性DNA分析.docVIP

　　远志种质资源遗传多样性随机扩增多态性DNA分析 【摘要】 目的用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术分析远志Polygala tenuifolia gCl2 2.0 μl,引物1.0 μl,模板2 ng,Taq酶0.3 μl。扩增程序为：94℃预变性4 min，然后进行45循环：94℃变性15 s，36℃复性1 min，72℃延伸1.3 min，循环结束后72℃延伸4 min。结果10个引物共检测到154个位点，平均每个引物扩增9.24条带，其中148条带表现为多态性，占总带数的94.3％；距离系数为24时，11个样品明显聚为远志居群和卵叶远志居群两类。结论远志与卵叶远志具有丰富的遗传多样性，遗传聚类与其地理分布有一定的相关性。 .L.编辑。 【关键词】 远志；卵叶远志；遗传多样性；随机扩增多态性DNA 　　Abstract:ObjectiveTo analyze geic diversity of Polygala tenuifolia yCyclerTM ThermalCycler（德国）；Therme ElectronTM 加样器。 　　1.2 试剂 　　10mer随机引物（北京赛百盛基因技术有限公司），λ-EcoT14I digest DNA Marker (TakaRa)，DNA Marker 15 000(TakaRa)，DNA Marker 2 000(TakaRa)，Taq酶(TaKaRa)2 500 U，dNTPs(TaKaRa) 2.5 mmol/L，MaCl2(TaKaRa)25 mmol/L，10×Buffer（Mg2＋ free）(TaKaRa)，CTAB(Amresco) ，PVP(Sigma)，β-巯基乙醇(Sigma)，琼脂糖（上海 YITO 生物仪器有限公司分发），其余为国产试剂。 　　1.3 材料 　　分别从四川、甘肃、陕西、山西、河北等地采得远志P. tenuifolia g用硅胶干燥的远志叶片，置-70℃冰箱冷冻1 h，取出后在研钵中快速磨成粉末，迅速将粉末转入1.5 ml离心管中，加入700 μl CTAB提取液，置65℃金属浴中30 min，其间不时摇动。②取出冷却至室温，加等体积氯仿/异戊醇（24∶1），混匀后于12 000 g/min离心10 min。③取上清液，重复操作②。④取上清，加入2/3体积的异丙醇，于-20℃放置30 min，于10 000 g/min 离心10 min，去上清。⑤用80％乙醇洗沉淀2次，风干沉淀。⑥将沉淀溶于100 μl ddH2O中，-20℃保存备用。 　　采用凝胶自动成像系统照相，检测DNA的质量和含量，取2 μl加样缓冲液（6×Buffer）与10 μl DNA样品混合，在0.9％琼脂糖凝胶上以5 V/cm电压条件下电泳，在紫外灯下观察电泳凝胶。用凝胶自动成像系统照相，用TotalLab软件分析凝胶图像，定量。基因组DNA电泳图谱见图1。 　　2.2 RAPD扩增条件的建立 　　分别对模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶用量等RAPD扩增条件进行优化。最终确定反应体系为：反应总体积25 μl，内含10×PCR buffer2.5 μl，dNTPs 2.0 μl，MgCl2 2.0μl，引物1.0 μl，模板2 ng，Taq酶0.3 μl。扩增程序为：94℃预变性4 min，然后进行45循环：94℃变性15 s，36℃复性1 min，72℃延伸1.3 min，循环结束后72℃延伸4 min，-4℃保存。扩增产物在1.4%琼脂糖凝胶上电泳，电压5 V/cm，电泳缓冲液为1×TAE。反应产物以DNA Marker 2000为分子量标记，在凝胶成像系统上观察、照像、记录。 　　2.3 引物筛选 　　利用建立的RAPD条件，对40条10 bp RAPD随机引物进行筛选，选扩增条带清晰、多态性强的10条引物作为RAPD引物。筛选引物的碱基序列见表2。 　　2.4 数据处理 　　每个样品电泳条带按有或无记录，电泳条带存在时赋值为1。否则赋值为0。利用SPSS10.0 按Nai＆Li(1979)的方法 计算 材料间遗传相似系数(GS)。计算公式为：GS=2Nxy /(Nx + Ny)，其中Nxy为材料x和y共有的扩增片段数目，Nx 、Ny为材料x、y中出现的扩增片段总数目。根据遗传距离，按UPGMA 法，选择类间平均连锁法（Bet.