限制性核酸内切酶精要.pptVIP

应用 DNA重组 限制酶（物理）图谱绘制 突变分析（RFLP分析） 限制酶的部分酶切与完全酶切 限制性核酸内切酶 于雪 果树学 1502011010 概念 限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。 主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制。 发现和历史 在本世纪中期，Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制和修饰系统。 经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌中存在一种酶，这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定的分离片段。 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶，并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列（Kelly Smith，1970）。这个酶现在命名为 Hind Ⅱ。 在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。 识别位点 大多数的Ⅱ型限制性内切酶，都能识别4~8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。这样的序列称为核酸内切限制酶的识别序列。 切割位点的共同特点是具有双重旋转对称的结构形式，就是指这些核苷酸对的顺序是呈回文结构的。例如： EcoRI 识别 GAATTC 切割类型 粘性末端：两条链上的断裂位置是交错的，但又对称的围绕着一个对称轴排列。 平末端：两条链的断裂位置是一个对称的结构。 平末端的DNA片段不容易重新环化。 至少存在 4 种不同类型的 R -M 系统：类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。它们之间的主要差异总结在表 3.1 中。 分类 是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。 不能产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带，因而不具备实用性。? Ⅰ型限制性内切酶 Ⅲ 型限制性内切酶 也是一类较大的兼有限制-修饰两种功能的酶。它们在识别位点之外切开 DNA 链，并且要求同一 DNA分子中存在两个反向的识别序列以完成切割。 这类酶很少能达到完全切割。 Ⅳ 型限制性内切酶 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。 Ⅱ型限制性内切酶 能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。 Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称序列； 最常见的 Ⅱ 型限制性内切酶 在特异性识别序列内部切割 DNA，如 HhaI、HindIII 。它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称序列； 但也有少量的酶与DNA 结合形成异二聚体，识别非对称序列（如BbvCI 识别 CCTCAGC）。 一些酶识别连续性序列（如 EcoRI 识别 GAATTC，其中的两个半识别序列是相连的）； 而另一些识别非连续性序列（如 BglI 识别CCNNNNNGGC，其中的两个半识别序列是不相连的）。 另一种比较常见的 Ⅱ 型限制性内切酶 ⅡS 型酶，如 FokI ，它们在识别位点之外切开 DNA。这些酶大小居中，约 400-650 个氨基酸，由 DNA 结合域和切割 DNA 的功能域组成。它们识别连续的非对称序列。 一般认为这些酶主要以单体的形式结合到 DNA 上，与邻近酶分子的切割功能域结合成二聚体，协同切开 DNA链。 FokI 条件 只有当镁离子存在时，它们才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺苷甲硫氨酸的存在。 限制性内切酶切割后产生一个 3 -羟基和一个 5 -磷酸基。 属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如果一种寄主菌株具有几个不同的限制与修饰体系，以罗马数字表示。 限制性内切酶命名 同裂酶 识别相同序列，但切割位点不同的酶，例如 SmaⅠ（CCC/GGG）和 XmaⅠ（C/CCGGG），称为新裂酶。 新裂酶 具有相同的序列特异性和切割位点的限制酶称为