青天葵组培物超低温保存研究.docVIP

　　青天葵组培物超低温保存研究 【摘要】 　　目的用超低温方法保存青天葵组培物。方法采用单因子比较法、均匀设计法考察生长周龄、冷冻保护剂、预培养时间、降温方式、化冻方式等因素对青天葵组培物超低温保存后细胞生活力的影响。结果青天葵组培物较佳的超低温保存程序为：５ 周龄的组培物，在４ ℃进行低温锻炼１２ ｄ，以１２．５ ％ＤＭＳＯ ＋０．２５％ＬＨ 为冷冻保护剂，在４℃静置处理３０ ｍｉｎ，然后在－１８℃，停留１ ｈ 后投入液氮中保存，材料取出后，在２０℃化冻，无菌洗涤后，再接种，组培物能够存活并继续生长。结论超低温保存方式可以成功保存青天葵组培物种质资源。 【关键词】 青天葵 组培物 超低温保存 　　Abstract：ObjectiveＴｏ ｐｒｅｓｅｒｖｅ the ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Nervilia fordii ｕｓｉｎｇ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．MethodsＳｕｉｔａｂｌｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ （ －１９６℃） ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｍｏｎｏｆａｃｔｏｒｉａｌ ａｎｄ ｕｎｉｆｏｒｍ ｄｅｓｉｇｎ.ResultsＴｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｆｉｖｅ －ｗｅｅｋｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌ ｆｏｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ．Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｕｒｅｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｆｏｒ １２ｄａｙｓ ａｔ ４℃ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｒｙｏｔｏｌｅｒａｎｔ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｙｒｏｐｒｅｃｔａｎｔｓ ｗａｓ １２．５％ＤＭＳＯ ＋０．２５％ＬＨ．Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗａｓ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ０℃ ｔｏ －１８℃，ａｎｄ ｓｔａｙ ａｔ ｔｈａｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ １ｈ， ｔｈｅｎ ｄｒｏｐ ｔｈｅｍ ｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ（ －１９６℃） ｔｏ ｂｅ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ．２０℃ ｗａｓ ｇｏｏｄ ｆｏｒ ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆｒｏｚｅｎ ｍａｔｅｒｉａｌ．Ｕｎｆｒｏｚｅｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｓｕｒｖｉｖｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｒｅｃｕlｔｕｒｅｄ ．ConclusionＴｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Nervil ia fordii ｃａｎ ｂｅ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ． 　　Key . 　　 ２　 结果分析 　　２．１ 组培物生长周龄对超低温保存后细胞生活力的影响细胞抗冻能力的提高与其分裂和生长活动等生理状态密切相关。取转移到新鲜培养基上的组培物，考察不同的生长周龄（１，２，３，４，５，６，７ 周）对组培物经超低温保存后的细胞生活力。结果见图１。 　　图1 组培物生长周龄对冷冻后细胞生活力的影响 （略）　 　　图2 预培养时间对超低温保存后细胞生活力的影响（略） 　　由图１ 知，将组培物转移至新鲜培养基上，开始１ 周，冷冻后细胞的ＴＴＣ 值较低，说明细胞的抗冻能力弱，培养至第２ 周时，ＴＴＣ 值迅速升高，细胞抗冻能力显著增强，第５ 周的ＴＴＣ 值最高，此时细胞的抗冻能力最强，此后，随着培养周龄的增加，ＴＴＣ值呈下降趋势，细胞抗冻能力逐渐减弱。因此选择５ 周龄的组培物作为超低温保存的材料是适宜的。 　　２．２ 冷冻保护剂对超低温保存后细胞生活力的影响结果见表１～２。 　　表1 U12（12）12均匀设计因子水平（略） 　　按表１ 均匀设计搭配，组合成１２ 种方案进行试验，结果见表２。 　　表2 U12（12）12均匀设计实验安排及结果（略） 　　数据经逐步回归处理，得到方程Y ＝０．３６９ ＋０．００４X１２ ＋４．４９５X６２ ，R ＝０．９０７ ＞０．９，F ＝２０．９２５ ＞F（７，４） ＝１４．６８，方程有显著性意义。由方程知，Ｘ１２ 和Ｘ２２ 对Ｙ 值有显著影响，均与Ｙ 值呈正相关。对方程优化得X１ ＝１２．５，X６ ＝０．２５，将其代入方程，得到优化值１．２７５，按公式Y ＝＾Ｙ ±Uα· Ｓ。当α＝０．１０，Uα ＝１．６４４ ８， 计算 优化值区间估计为Y ＝１．２７５ ±１．６４４ ８×０．１２，即１．０７８ ～１．４７２。按照优化条件进行试验，得到TTC 值为１．２８１，在Y 值区域内，且比１２ 次均匀试验Y 值都高，说明所得结果是正确的，因此认为１２．５％ＤＭＳＯ ＋０．２５％ＬＨ是青天葵组织培养物较佳的冷冻保护剂。 　　２．３ 组培物预培养时间对超低温保存后细胞生活力的影响结果见图２。图２ 表明，未经